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IGNOU BBCCT-105 Solved Question Paper PDF
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IGNOU BBCCT-105 Previous Year Solved Question Paper in Hindi
Q1. (क) प्रोटीन की विशेषताएँ सूचीबद्ध कीजिए । उन्हें विस्तार से बताइए। (ख) समांगीकरण और पराध्वनिकरण में अन्तर कीजिए एवं उचित उदाहरण सहित समझाइए।
Ans.
(क) प्रोटीन की विशेषताएँ प्रोटीन अमीनो एसिड से बने जटिल, उच्च आणविक भार वाले मैक्रोमोलेक्यूल्स होते हैं। उनकी कुछ प्रमुख विशेषताएँ निम्नलिखित हैं:
- आणविक भार: प्रोटीन का आणविक भार बहुत अधिक होता है, जो कुछ हजार से लेकर कई मिलियन डाल्टन तक हो सकता है। यह प्रोटीन में मौजूद अमीनो एसिड की संख्या और प्रकार पर निर्भर करता है।
- अम्लीय और क्षारीय गुण (Amphoteric Nature): प्रोटीन में अमीनो और कार्बोक्सिल दोनों समूह होते हैं, इसलिए वे एम्फोटेरिक यौगिकों के रूप में कार्य करते हैं। वे अम्ल और क्षार दोनों के साथ अभिक्रिया कर सकते हैं। जिस pH पर प्रोटीन पर कुल आवेश शून्य होता है, उसे आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट (pI) कहा जाता है।
- संरचनात्मक स्तर: प्रोटीन की संरचना के चार स्तर होते हैं:
- प्राथमिक संरचना: पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला में अमीनो एसिड का रैखिक अनुक्रम।
- द्वितीयक संरचना: पॉलीपेप्टाइड बैकबोन की स्थानीय फोल्डिंग, जिससे अल्फा-हेलिक्स (α-helix) और बीटा-शीट (β-sheet) जैसी संरचनाएं बनती हैं।
- तृतीयक संरचना: एक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला की समग्र 3-डी फोल्डिंग।
- चतुर्धातुक संरचना: कई पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं (सबयूनिट्स) का संयोजन।
- विकृतीकरण (Denaturation): जब प्रोटीन को अत्यधिक गर्मी, pH में परिवर्तन, या रासायनिक एजेंटों के संपर्क में लाया जाता है, तो उसकी तृतीयक और द्वितीयक संरचनाएं नष्ट हो जाती हैं। इस प्रक्रिया को विकृतीकरण कहते हैं, जिससे प्रोटीन अपनी जैविक गतिविधि खो देता है।
- विलेयता (Solubility): प्रोटीन की विलेयता उसके आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट (pI) पर सबसे कम होती है। इस बिंदु पर, वे आसानी से अवक्षेपित हो जाते हैं। लवणों की सांद्रता भी विलेयता को प्रभावित करती है; कम सांद्रता में यह विलेयता बढ़ाती है (salting in) और उच्च सांद्रता में घटाती है (salting out)।
- जैविक क्रियाशीलता: प्रत्येक प्रोटीन का एक विशिष्ट कार्य होता है, जो उसकी अनूठी 3-डी संरचना द्वारा निर्धारित होता है। वे एंजाइम, हार्मोन, एंटीबॉडी और संरचनात्मक घटकों के रूप में कार्य करते हैं।
(ख) समांगीकरण और पराध्वनिकरण के बीच अंतर
समांगीकरण (Homogenization) और पराध्वनिकरण (Ultrasonication) दोनों ही कोशिका विघटन (cell disruption) की विधियाँ हैं जिनका उपयोग कोशिकाओं या ऊतकों से इंट्रासेल्युलर घटकों (जैसे प्रोटीन) को निकालने के लिए किया जाता है। हालांकि, वे अपने सिद्धांत और अनुप्रयोग में भिन्न हैं।
समांगीकरण (Homogenization):
- सिद्धांत: यह एक यांत्रिक विधि है जो कोशिकाओं को तोड़ने के लिए कतरनी बलों (shearing forces) का उपयोग करती है। नमूने को एक संकीर्ण स्थान से बलपूर्वक गुजारा जाता है, जिससे कोशिकाएं फट जाती हैं।
- प्रक्रिया: इसमें आमतौर पर एक विशेष उपकरण का उपयोग होता है जिसे होमोजेनाइज़र कहते हैं।
- उदाहरण 1: डounce होमोजेनाइज़र (Dounce homogenizer): इसमें एक कांच की ट्यूब और एक कसकर फिट होने वाला मूसल (pestle) होता है। मूसल को ऊपर और नीचे ले जाकर ऊतक को पीसकर कोशिकाओं को तोड़ा जाता है। यह स्तनधारी कोशिकाओं जैसी कोमल कोशिकाओं के लिए उपयुक्त है।
- उदाहरण 2: पॉटर-एल्वेह्जेम होमोजेनाइज़र (Potter-Elvehjem homogenizer): यह डounce होमोजेनाइज़र के समान है लेकिन इसमें एक टेफ्लॉन मूसल होता है और इसे मोटर द्वारा चलाया जा सकता है, जो कठोर ऊतकों के लिए अधिक प्रभावी है।
- विशेषताएँ: यह बड़े नमूनों के लिए अच्छा है और अक्सर कम गर्मी उत्पन्न करता है, जिससे गर्मी के प्रति संवेदनशील प्रोटीन को बचाया जा सकता है।
पराध्वनिकरण (Ultrasonication):
- सिद्धांत: यह विधि उच्च-आवृत्ति वाली ध्वनि तरंगों (आमतौर पर 20 kHz से अधिक) का उपयोग करती है। ये तरंगें तरल में तीव्र दाब परिवर्तन उत्पन्न करती हैं, जिससे छोटे बुलबुले बनते और फटते हैं। इस प्रक्रिया को कैविटेशन (cavitation) कहते हैं। बुलबुले के फटने से उत्पन्न शॉक वेव आस-पास की कोशिकाओं को तोड़ देती हैं।
- प्रक्रिया: एक उपकरण जिसे सोनिकेटर (sonicator) कहा जाता है, का उपयोग किया जाता है। इसमें एक टाइटेनियम प्रोब होता है जो उच्च आवृत्ति पर कंपन करता है और इसे सीधे नमूना निलंबन में डुबोया जाता है।
- उदाहरण: बैक्टीरिया या यीस्ट जैसी कठोर कोशिका भित्ति वाली कोशिकाओं को तोड़ने के लिए सोनिक प्रोब का उपयोग करना।
- विशेषताएँ: यह बहुत प्रभावी और तीव्र है, विशेष रूप से माइक्रोबियल कोशिकाओं के लिए। हालांकि, यह काफी गर्मी उत्पन्न कर सकता है, इसलिए नमूने को ठंडा रखना (जैसे बर्फ पर) महत्वपूर्ण है ताकि प्रोटीन का विकृतीकरण न हो।
मुख्य अंतर:
गुण समांगीकरण पराध्वनिकरण कार्यकारी सिद्धांत यांत्रिक कतरनी (Mechanical shear) ध्वनि-प्रेरित कैविटेशन (Sound-induced cavitation) उपकरण होमोजेनाइज़र (जैसे, डounce) सोनिकेटर (Sonicator) उपयुक्तता कोमल ऊतक और कोशिकाएं कठोर कोशिका भित्ति (जैसे, बैक्टीरिया, यीस्ट) गर्मी उत्पादन आमतौर पर कम उच्च, शीतलन आवश्यक है
Q2. निम्नलिखित पर संक्षिप्त टिप्पणियाँ लिखिए : (क) बाइयूरेट परीक्षण (ख) हिमशुष्कन (ग) आयन विनिमय वर्णलेखन (घ) पेपर वर्णलेखन
Ans.
(क) बाइयूरेट परीक्षण (Biuret test)
बाइयूरेट परीक्षण एक गुणात्मक जैव रासायनिक परीक्षण है जिसका उपयोग प्रोटीन में पेप्टाइड बंधों की उपस्थिति का पता लगाने के लिए किया जाता है। इसका सिद्धांत यह है कि क्षारीय माध्यम में, दो या दो से अधिक पेप्टाइड बंध वाले यौगिक कॉपर सल्फेट (CuSO₄) के साथ अभिक्रिया करके एक बैंगनी (violet) रंग का कॉम्प्लेक्स बनाते हैं। अभिक्रिया के लिए कम से कम दो पेप्टाइड बंधों की आवश्यकता होती है, इसलिए यह परीक्षण मुक्त अमीनो एसिड या डाइपेप्टाइड के लिए सकारात्मक परिणाम नहीं देता है। परीक्षण का नाम बाइयूरेट अणु (NH₂-CO-NH-CO-NH₂) के नाम पर रखा गया है, जो इस परीक्षण के लिए सकारात्मक परिणाम देता है। प्रक्रिया में, परीक्षण विलयन में पहले सोडियम हाइड्रॉक्साइड (NaOH) जैसा एक मजबूत क्षार मिलाया जाता है, और फिर कॉपर सल्फेट का जलीय घोल मिलाया जाता है। बैंगनी रंग की तीव्रता प्रोटीन की सांद्रता के समानुपाती होती है, इसलिए इसका उपयोग प्रोटीन के मात्रात्मक अनुमान के लिए भी किया जा सकता है।
(ख) हिमशुष्कन (Lyophilisation)
हिमशुष्कन, जिसे फ्रीज-ड्राइंग (freeze-drying) भी कहा जाता है, एक निर्जलीकरण प्रक्रिया है जिसका उपयोग गर्मी के प्रति संवेदनशील सामग्रियों, जैसे प्रोटीन, टीके और फार्मास्यूटिकल्स को संरक्षित करने के लिए किया जाता है। इस प्रक्रिया में पानी को सीधे ठोस अवस्था (बर्फ) से गैस अवस्था (वाष्प) में परिवर्तित किया जाता है, जिसे ऊर्ध्वपातन (sublimation) कहते हैं। इसके तीन मुख्य चरण हैं:
- हिमीकरण (Freezing): उत्पाद को उसके त्रिगुण बिंदु (triple point) से नीचे के तापमान पर तेजी से जमाया जाता है ताकि बड़े बर्फ क्रिस्टल बनने से बचा जा सके, जो कोशिका संरचना को नुकसान पहुंचा सकते हैं।
- प्राथमिक शुष्कन (Primary Drying): दाब को बहुत कम कर दिया जाता है और बर्फ के ऊर्ध्वपातन के लिए थोड़ी गर्मी प्रदान की जाती है। इस चरण में लगभग 95% पानी निकाल दिया जाता है।
- द्वितीयक शुष्कन (Secondary Drying): बची हुई नमी (adsorbed water) को निकालने के लिए तापमान को थोड़ा बढ़ाया जाता है जबकि दाब कम रहता है।
अंतिम उत्पाद एक सूखा, छिद्रपूर्ण पाउडर होता है जिसे आसानी से पुनर्गठित किया जा सकता है और कमरे के तापमान पर लंबे समय तक स्थिर रहता है।
(ग) आयन विनिमय वर्णलेखन (Ion exchange chromatography)
आयन विनिमय वर्णलेखन (IEC) एक शक्तिशाली शुद्धिकरण तकनीक है जो अणुओं को उनके कुल आवेश के आधार पर अलग करती है। इसका सिद्धांत यह है कि आवेशित अणु एक विपरीत आवेश वाले स्थिर चरण (stationary phase) से बंध जाते हैं। स्थिर चरण एक राल (resin) या मैट्रिक्स होता है जिस पर आयनिक कार्यात्मक समूह जुड़े होते हैं।
- धनायन विनिमय (Cation Exchange): स्थिर चरण पर ऋणात्मक आवेश होता है (जैसे, कार्बोक्सिमिथाइल समूह) और यह धनावेशित अणुओं (cations) को बांधता है।
- ऋणायन विनिमय (Anion Exchange): स्थिर चरण पर धनात्मक आवेश होता है (जैसे, DEAE – डायथाइलअमीनोएथिल) और यह ऋणावेशित अणुओं (anions) को बांधता है।
प्रक्रिया में, प्रोटीन मिश्रण को एक कॉलम से गुजारा जाता है जिसमें आयन-विनिमय राल होता है। वांछित pH पर, जो प्रोटीन अपने pI से ऊपर या नीचे होता है, वह राल से बंध जाएगा, जबकि अन्य प्रोटीन बह जाएंगे। बंधे हुए प्रोटीन को बाद में या तो pH बदलकर या लवण प्रवणता (salt gradient) का उपयोग करके बाहर निकाला (elute) जाता है। लवण के आयन प्रोटीन के लिए प्रतिस्पर्धा करते हैं और उन्हें राल से विस्थापित कर देते हैं।
(घ) पेपर वर्णलेखन (Paper chromatography)
पेपर वर्णलेखन एक विश्लेषणात्मक तकनीक है जिसका उपयोग मिश्रण के घटकों को अलग करने के लिए किया जाता है। यह एक प्रकार की विभाजन वर्णलेखन (partition chromatography) है। इसमें, स्थिर चरण एक विशेष प्रकार का कागज (सेलूलोज) होता है जिस पर पानी सोखा होता है, और गतिशील चरण एक कार्बनिक विलायक होता है। सिद्धांत यह है कि मिश्रण के घटक स्थिर और गतिशील चरणों के बीच अपनी भिन्न विलेयता और अधिशोषण के आधार पर अलग-अलग गति से चलते हैं। प्रक्रिया में, नमूना मिश्रण की एक छोटी बूंद कागज की आधार रेखा पर लगाई जाती है। फिर कागज के किनारे को एक बंद कक्ष में विलायक में डुबोया जाता है। केशिका क्रिया (capillary action) द्वारा विलायक कागज पर ऊपर की ओर बढ़ता है और नमूने को अपने साथ ले जाता है। अधिक घुलनशील और कम अधिशोषित होने वाले घटक तेजी से आगे बढ़ते हैं। पृथक्करण के बाद, प्रत्येक घटक द्वारा तय की गई दूरी को मापा जाता है और प्रतिधारण कारक (Rf value) की गणना की जाती है:
Rf = घटक द्वारा तय की गई दूरी / विलायक द्वारा तय की गई दूरी
Rf मान एक दिए गए विलायक प्रणाली में एक यौगिक की विशेषता है।
Q3. (क) द्विविमीय जैल वैद्युतकणसंचलन का वर्णन कीजिए। वैद्युतकणसंचलन के अनुप्रयोगों को सूचीबद्ध कीजिए। (ख) प्रोटीन अनुक्रमण क्या होता है ? प्रोटीन अनुक्रमण की एडमैन अपघटन विधि का वर्णन कीजिए।
Ans.
(क) द्विविमीय (2-D) जैल वैद्युतकणसंचलन
द्विविमीय (2-D) जैल वैद्युतकणसंचलन एक शक्तिशाली प्रोटीन पृथक्करण तकनीक है जो प्रोटीन मिश्रण को दो अलग-अलग भौतिक गुणों के आधार पर अलग करती है। यह पारंपरिक SDS-PAGE की तुलना में बहुत अधिक विभेदन क्षमता (resolution) प्रदान करती है। इसके दो चरण होते हैं:
1. पहला आयाम: आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग (IEF)
इस चरण में, प्रोटीन को उनके आइसोइलेक्ट्रिक पॉइंट (pI) के आधार पर अलग किया जाता है। प्रोटीन मिश्रण को एक पतली स्ट्रिप जैल पर लोड किया जाता है जिसमें एक स्थिर pH प्रवणता (gradient) होती है। जब एक विद्युत क्षेत्र लागू किया जाता है, तो प्रोटीन उस pH की ओर पलायन करते हैं जो उनके pI के बराबर होता है।
- pH < pI पर, प्रोटीन धनावेशित होता है और कैथोड (ऋणात्मक इलेक्ट्रोड) की ओर बढ़ता है।
- pH > pI पर, प्रोटीन ऋणावेशित होता है और एनोड (धनात्मक इलेक्ट्रोड) की ओर बढ़ता है।
प्रोटीन तब तक पलायन करता रहता है जब तक कि वह जैल के उस बिंदु पर नहीं पहुंच जाता जहां pH उसके pI के बराबर हो। इस बिंदु पर, प्रोटीन पर कुल आवेश शून्य हो जाता है, और वह विद्युत क्षेत्र में चलना बंद कर देता है। इस प्रकार प्रोटीन अपने pI मान के अनुसार जैल में केंद्रित हो जाते हैं।
2. दूसरा आयाम: SDS-PAGE (सोडियम डोडेसिल सल्फेट पॉलीएक्रिलामाइड जैल वैद्युतकणसंचलन) IEF स्ट्रिप को फिर एक SDS-PAGE जैल के ऊपर रखा जाता है। SDS एक आयनिक डिटर्जेंट है जो प्रोटीन को विकृत करता है और उन्हें एक समान ऋणात्मक आवेश प्रदान करता है, जो उनके द्रव्यमान के अनुपात में होता है। अब, जब दूसरा विद्युत क्षेत्र IEF स्ट्रिप के लंबवत लगाया जाता है, तो प्रोटीन IEF स्ट्रिप से बाहर निकलकर SDS-PAGE जैल में चले जाते हैं। इस जैल में, प्रोटीन केवल अपने आणविक भार के आधार पर अलग होते हैं। छोटे प्रोटीन तेजी से आगे बढ़ते हैं, जबकि बड़े प्रोटीन जैल मैट्रिक्स में फंसकर धीरे-धीरे चलते हैं। अंतिम परिणाम एक 2-D जैल होता है जिस पर प्रोटीन धब्बे (spots) के रूप में दिखाई देते हैं, जहां प्रत्येक धब्बा एक विशिष्ट प्रोटीन का प्रतिनिधित्व करता है जो अपने अद्वितीय pI (x-अक्ष) और आणविक भार (y-अक्ष) के अनुसार स्थित होता है।
वैद्युतकणसंचलन के अनुप्रयोग:
- प्रोटीन पृथक्करण और शुद्धिकरण: मिश्रण से व्यक्तिगत प्रोटीन को अलग करना।
- आणविक भार का निर्धारण: अज्ञात प्रोटीन के आणविक भार का अनुमान लगाना।
- प्रोटीओमिक्स: 2-D जैल वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कोशिका या ऊतक में व्यक्त होने वाले संपूर्ण प्रोटीन सेट (प्रोटीओम) का विश्लेषण करने के लिए किया जाता है।
- रोग निदान: रोगों से जुड़े विशिष्ट प्रोटीन (बायोमार्कर) की पहचान करना।
- प्रोटीन अभिव्यक्ति का तुलनात्मक विश्लेषण: विभिन्न परिस्थितियों (जैसे, स्वस्थ बनाम रोगग्रस्त) में प्रोटीन अभिव्यक्ति के स्तर में परिवर्तन का अध्ययन करना।
- न्यूक्लिक एसिड विश्लेषण: डीएनए और आरएनए के टुकड़ों को उनके आकार के अनुसार अलग करना (जैसे, एगारोज जैल वैद्युतकणसंचलन में)।
(ख) प्रोटीन अनुक्रमण और एडमैन अपघटन
प्रोटीन अनुक्रमण (Protein Sequencing) वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा एक प्रोटीन या पॉलीपेप्टाइड में अमीनो एसिड के अनुक्रम (प्राथमिक संरचना) का निर्धारण किया जाता है। प्रोटीन का कार्य उसकी विशिष्ट अमीनो एसिड अनुक्रम पर बहुत अधिक निर्भर करता है, जो उसकी 3-डी संरचना को निर्धारित करता है।
एडमैन अपघटन (Edman Degradation) विधि:
एडमैन अपघटन प्रोटीन के N-टर्मिनल से अमीनो एसिड का अनुक्रम निर्धारित करने के लिए सबसे व्यापक रूप से इस्तेमाल की जाने वाली विधि है। इसे पेहर एडमैन ने विकसित किया था। यह एक चक्रीय प्रक्रिया है जिसमें प्रत्येक चक्र में पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के N-टर्मिनल अमीनो एसिड को हटाया और पहचाना जाता है। प्रक्रिया के मुख्य चरण इस प्रकार हैं:
1. युग्मन (Coupling): पॉलीपेप्टाइड को हल्के क्षारीय माध्यम (pH ~9.0) में फेनिलआइसोथियोसाइनेट (Phenylisothiocyanate – PITC) के साथ अभिकृत किया जाता है। PITC पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के अनावेशित N-टर्मिनल α-अमीनो समूह के साथ अभिक्रिया करके एक फेनिलथियोकार्बामिल (PTC) व्युत्पन्न बनाता है।
(PITC + N-टर्मिनल अमीनो एसिड) → PTC-पॉलीपेप्टाइड
2. विदलन (Cleavage): इसके बाद, निर्जल ट्राईफ्लोरोएसिटिक एसिड (TFA) जैसे प्रबल अम्ल के साथ अभिक्रिया कराई जाती है। यह अम्ल N-टर्मिनल अवशेष और शेष पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के बीच पेप्टाइड बंध को चुनिंदा रूप से तोड़ता है। यह एक थियाजोलिनोन (thiazolinone) व्युत्पन्न के रूप में N-टर्मिनल अमीनो एसिड को मुक्त करता है। शेष पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला अब एक अमीनो एसिड छोटी हो जाती है और अगले चक्र के लिए तैयार होती है। (PTC-पॉलीपेप्टाइड + TFA) → थियाजोलिनोन-अमीनो एसिड + पॉलीपेप्टाइड (n-1)
3. रूपांतरण और पहचान (Conversion and Identification): अस्थिर थियाजोलिनोन व्युत्पन्न को जलीय अम्ल के साथ गर्म करके एक अधिक स्थिर फेनिलथियोहाइडैन्टोइन (Phenylthiohydantoin – PTH) व्युत्पन्न में परिवर्तित किया जाता है। (थियाजोलिनोन-अमीनो एसिड + H⁺) → PTH-अमीनो एसिड इस PTH-अमीनो एसिड की पहचान क्रोमैटोग्राफी, आमतौर पर HPLC (उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी) द्वारा की जाती है। प्रत्येक अमीनो एसिड का अपना विशिष्ट PTH व्युत्पन्न होता है, जिसे ज्ञात मानकों से तुलना करके पहचाना जा सकता है।
इस प्रक्रिया को बार-बार दोहराया जाता है, जिससे पॉलीपेप्टाइड का अनुक्रम N-टर्मिनस से एक-एक करके निर्धारित किया जा सकता है। स्वचालित सीक्वेंसर, जिन्हें एडमैन सीक्वेंसर भी कहा जाता है, इस प्रक्रिया को लगभग 30-60 अवशेषों तक कुशलतापूर्वक कर सकते हैं।
Q4. (क) द्रव्यमान स्पेक्ट्रमिति के सिद्धान्त और अवयवों का विवरण दीजिए। (ख) उदाहरण/चित्र सहित निम्नलिखित की व्याख्या कीजिए : (i) एंडोपेप्टाइडेज़ और एक्सोपेप्टाइडेज़ (ii) एगारोज जैल मैट्रिक्स
Ans.
(क) द्रव्यमान स्पेक्ट्रमिति (Mass Spectrometry) का सिद्धांत और अवयव
सिद्धांत:
द्रव्यमान स्पेक्ट्रमिति (Mass Spectrometry – MS) एक शक्तिशाली विश्लेषणात्मक तकनीक है जिसका उपयोग अणुओं के द्रव्यमान-से-आवेश अनुपात (mass-to-charge ratio, m/z) को मापने के लिए किया जाता है। यह प्रोटीन और पेप्टाइड्स की पहचान और लक्षण वर्णन के लिए प्रोटीओमिक्स में एक महत्वपूर्ण उपकरण है। MS का मूल सिद्धांत तीन चरणों पर आधारित है:
- आयनीकरण (Ionization): विश्लेषण किए जाने वाले नमूने (analyte) के अणुओं को गैस-चरण आयनों में परिवर्तित किया जाता है। प्रोटीन विश्लेषण के लिए, कोमल आयनीकरण तकनीकें जैसे इलेक्ट्रोस्प्रे आयनीकरण (ESI) और मैट्रिक्स-असिस्टेड लेजर डिसॉर्प्शन/आयनीकरण (MALDI) का उपयोग किया जाता है ताकि बड़े अणुओं को बिना तोड़े आयनित किया जा सके।
- पृथक्करण (Separation): उत्पन्न आयनों को एक विद्युत और/या चुंबकीय क्षेत्र में त्वरित किया जाता है और एक द्रव्यमान विश्लेषक (mass analyzer) में भेजा जाता है। द्रव्यमान विश्लेषक इन आयनों को उनके m/z अनुपात के आधार पर अलग करता है। विभिन्न m/z मान वाले आयन क्षेत्र में अलग-अलग पथ या गति का अनुसरण करते हैं।
- पहचान (Detection): अलग किए गए आयन एक डिटेक्टर से टकराते हैं, जो एक संकेत उत्पन्न करता है। प्रत्येक m/z मान पर आयनों की सापेक्ष बहुतायत (relative abundance) को मापा जाता है। परिणाम एक द्रव्यमान स्पेक्ट्रम के रूप में प्रस्तुत किया जाता है, जो m/z के विरुद्ध आयन तीव्रता का एक ग्राफ होता है।
अवयव:
एक विशिष्ट द्रव्यमान स्पेक्ट्रोमीटर में निम्नलिखित मुख्य अवयव होते हैं:
- नमूना प्रवेश प्रणाली (Sample Inlet): यह नमूने को उपकरण में प्रवेश कराता है। यह एक क्रोमैटोग्राफी प्रणाली (जैसे HPLC) से सीधे जुड़ा हो सकता है।
- आयन स्रोत (Ion Source): यह वह जगह है जहाँ नमूना आयनित होता है। MALDI और ESI प्रोटीन के लिए सबसे आम स्रोत हैं।
- MALDI: नमूने को एक मैट्रिक्स के साथ मिलाया जाता है और लेजर पल्स द्वारा आयनित किया जाता है। यह मुख्य रूप से एकल आवेशित आयन बनाता है।
- ESI: नमूना विलयन को एक उच्च वोल्टेज वाली केशिका के माध्यम से स्प्रे किया जाता है, जिससे बहु-आवेशित आयन बनते हैं।
- द्रव्यमान विश्लेषक (Mass Analyzer): यह आयन स्रोत और डिटेक्टर के बीच का “हृदय” है। यह आयनों को उनके m/z के आधार पर अलग करता है। सामान्य प्रकारों में टाइम-ऑफ-फ्लाइट (TOF) , क्वाड्रुपोल (Quadrupole) , और आयन ट्रैप (Ion Trap) शामिल हैं।
- डिटेक्टर (Detector): यह अलग किए गए आयनों को रिकॉर्ड करता है और उनकी संख्या को मापता है। यह आयनों के प्रभाव को एक विद्युत संकेत में परिवर्तित करता है, जिसे फिर संसाधित किया जाता है।
- वैक्यूम सिस्टम (Vacuum System): आयनों को अन्य अणुओं के साथ टकराव के बिना स्वतंत्र रूप से यात्रा करने की अनुमति देने के लिए पूरे उपकरण (आयन स्रोत को छोड़कर) को उच्च वैक्यूम के तहत रखा जाता है।
(ख) उदाहरण सहित व्याख्या
(i) एंडोपेप्टाइडेज़ और एक्सोपेप्टाइडेज़ (Endopeptidases and Exopeptidases)
पेप्टाइडेज़ (या प्रोटीज) वे एंजाइम होते हैं जो पेप्टाइड बंधों को तोड़ते हैं। उन्हें उनकी क्रिया के स्थल के आधार पर दो मुख्य समूहों में वर्गीकृत किया जा सकता है:
एंडोपेप्टाइडेज़:
ये एंजाइम पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के भीतर विशिष्ट पेप्टाइड बंधों को तोड़ते हैं। वे टर्मिनल सिरों पर कार्य नहीं करते हैं। उनकी क्रिया से बड़े पॉलीपेप्टाइड छोटे पेप्टाइड्स में टूट जाते हैं। वे अक्सर विशिष्ट अमीनो एसिड अनुक्रमों को पहचानते हैं।
- उदाहरण 1: ट्रिप्सिन (Trypsin): यह एक पाचन एंजाइम है जो लाइसिन (Lys) और आर्जिनिन (Arg) के कार्बोक्सिल पक्ष पर पेप्टाइड बंध को तोड़ता है।
- उदाहरण 2: काइमोट्रिप्सिन (Chymotrypsin): यह बड़े हाइड्रोफोबिक अमीनो एसिड जैसे फेनिलएलनिन (Phe), ट्रिप्टोफैन (Trp), और टायरोसिन (Tyr) के कार्बोक्सिल पक्ष पर बंध को तोड़ता है।
चित्रण:
…-Ala-Gly- Lys -|- Ala -Pro-Phe-…. (ट्रिप्सिन यहाँ ‘Lys’ के बाद काटेगा)
एक्सोपेप्टाइडेज़:
ये एंजाइम पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के सिरों (टर्मिनस) से एक-एक करके अमीनो एसिड को हटाते हैं।
- अमीनोपेप्टाइडेज़ (Aminopeptidases): ये N-टर्मिनस (अमीनो सिरे) से अमीनो एसिड को हटाते हैं।
- कार्बोक्सीपेप्टाइडेज़ (Carboxypeptidases): ये C-टर्मिनस (कार्बोक्सिल सिरे) से अमीनो एसिड को हटाते हैं।
- उदाहरण: कार्बोक्सीपेप्टाइडेज़ A (Carboxypeptidase A): यह C-टर्मिनल सुगंधित या एलिफैटिक अमीनो एसिड को हटाता है।
चित्रण:
NH₂- Ala -Gly-Lys-Ala-Pro- Phe -COOH
- अमीनोपेप्टाइडेज़ ‘Ala’ को हटाएगा।
- कार्बोक्सीपेप्टाइडेज़ ‘Phe’ को हटाएगा।
(ii) एगारोज जैल मैट्रिक्स (Agarose Gel Matrix)
एगारोज एक प्राकृतिक पॉलीसेकेराइड है जो समुद्री शैवाल से प्राप्त होता है। यह गैलेक्टोज का एक रैखिक बहुलक है। जब एगारोज पाउडर को बफर में गर्म किया जाता है और फिर ठंडा किया जाता है, तो यह एक क्रॉस-लिंक्ड, छिद्रपूर्ण जैल मैट्रिक्स बनाता है। यह मैट्रिक्स आणविक छलनी (molecular sieve) के रूप में कार्य करता है।
संरचना और कार्य:
एगारोज की श्रृंखलाएं हाइड्रोजन बंधों के माध्यम से एक साथ जुड़कर तंतुओं (fibers) के एक 3-डी नेटवर्क का निर्माण करती हैं। इन तंतुओं के बीच के स्थान छिद्र (pores) बनाते हैं। इन छिद्रों का आकार एगारोज की सांद्रता पर निर्भर करता है:
- कम सांद्रता (जैसे, 0.7%): बड़े छिद्र बनते हैं, जो बहुत बड़े अणुओं (जैसे, बड़े डीएनए टुकड़े) को अलग करने के लिए उपयुक्त होते हैं।
- उच्च सांद्रता (जैसे, 2.0%): छोटे छिद्र बनते हैं, जो छोटे अणुओं (जैसे, छोटे डीएनए टुकड़े) को अलग करने के लिए उपयुक्त होते हैं।
जब इस जैल के माध्यम से एक विद्युत क्षेत्र लगाया जाता है (एगारोज जैल वैद्युतकणसंचलन में), तो ऋणावेशित अणु (जैसे डीएनए, जो फॉस्फेट बैकबोन के कारण ऋणावेशित होता है) धनात्मक इलेक्ट्रोड (एनोड) की ओर बढ़ते हैं। अणु इस मैट्रिक्स से होकर गुजरते हैं। छोटे अणु छिद्रों से आसानी से गुजर सकते हैं और तेजी से आगे बढ़ते हैं, जबकि बड़े अणु मैट्रिक्स में अधिक फंसते हैं और धीरे-धीरे चलते हैं। इस प्रकार, एगारोज जैल अणुओं को उनके आकार के आधार पर अलग करता है।
चित्रण: एक आरेख में एगारोज तंतुओं का एक उलझा हुआ नेटवर्क दिखाया जा सकता है, जिसके बीच में छिद्र होते हैं। छोटे और बड़े अणु इन छिद्रों से होकर अलग-अलग गति से गुजरते हुए दिखाए जा सकते हैं।
Q5. (क) α-कुंडलिनी और β-परत में अन्तर बताइए। (ख) प्रोटीन की 3-डी/त्रिआयामी संरचना के अध्ययन के लिए कोई दो तकनीकें बताइए ।
Ans.
(क) α-कुंडलिनी (α-helix) और β-परत (β-sheet) में अंतर
α-कुंडलिनी और β-परत प्रोटीन की द्वितीयक संरचना के दो सबसे सामान्य प्रकार हैं। ये पॉलीपेप्टाइड बैकबोन की स्थानीय, नियमित फोल्डिंग पैटर्न हैं जो बैकबोन के C=O और N-H समूहों के बीच हाइड्रोजन बंधों द्वारा स्थिर होते हैं। इनमें मुख्य अंतर निम्नलिखित हैं:
गुण
α-कुंडलिनी (Alpha-helix)
β-परत (Beta-sheet)
संरचना
एक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला अपने अक्ष के चारों ओर एक दाएं हाथ की कुंडलित (coiled) या स्प्रिंग जैसी संरचना बनाती है।
पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के एक या अधिक खंड लगभग पूरी तरह से विस्तारित होकर एक-दूसरे के समानांतर या प्रति-समानांतर स्थित होते हैं, जिससे एक प्लीटेड (pleated) या मुड़ी हुई परत जैसी संरचना बनती है।
हाइड्रोजन बंध
हाइड्रोजन बंध इंट्रामोल्यूक्यूलर (intramolecular) होते हैं, यानी एक ही पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला के भीतर बनते हैं। एक अमीनो एसिड (n) का C=O समूह, उससे चार अवशेष आगे स्थित अमीनो एसिड (n+4) के N-H समूह के साथ बंध बनाता है।
हाइड्रोजन बंध इंटर-स्ट्रैंड (inter-strand) होते हैं। वे या तो एक ही श्रृंखला के अलग-अलग खंडों (इंट्रामोल्यूक्यूलर) या अलग-अलग पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं (इंटरमोल्यूक्यूलर) के बीच बन सकते हैं।
अमीनो एसिड R-समूहों की दिशा
R-समूह (साइड चेन) हेलिक्स के अक्ष से बाहर की ओर निकले रहते हैं, ताकि वे एक-दूसरे से न टकराएं।
R-समूह परत के तल के ऊपर और नीचे एकांतर (alternating) रूप से स्थित होते हैं।
कुंडलिनी अक्ष के समानांतर बंध
हाइड्रोजन बंध लगभग कुंडलिनी अक्ष के समानांतर (parallel) होते हैं।
हाइड्रोजन बंध परत के तल के लंबवत (perpendicular) होते हैं।
उदाहरण
बालों और ऊन में पाया जाने वाला α-केराटिन (α-keratin) , मायोग्लोबिन और हीमोग्लोबिन में हेलिकल खंड।
रेशम में पाया जाने वाला सिल्क फाइब्रोइन (silk fibroin) , एंटीबॉडी में β-बैरल संरचनाएं।
(ख) प्रोटीन की 3-डी संरचना के अध्ययन के लिए दो तकनीकें
प्रोटीन की त्रिआयामी (3-D) या तृतीयक संरचना का निर्धारण उसके कार्य को समझने के लिए महत्वपूर्ण है। इसके लिए दो प्रमुख तकनीकें हैं:
1. एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी (X-ray Crystallography) यह प्रोटीन की 3-डी संरचना का परमाणु-स्तर का विभेदन (atomic-level resolution) प्रदान करने वाली सबसे शक्तिशाली और व्यापक रूप से उपयोग की जाने वाली तकनीक है।
- सिद्धांत: जब उच्च-ऊर्जा वाले एक्स-रे की एक किरण को एक सुव्यवस्थित, एकल प्रोटीन क्रिस्टल से गुजारा जाता है, तो क्रिस्टल में मौजूद इलेक्ट्रॉन एक्स-रे को विवर्तित (diffract) करते हैं। यह एक विशिष्ट विवर्तन पैटर्न (diffraction pattern) उत्पन्न करता है, जिसमें हजारों धब्बे होते हैं। इन धब्बों की स्थिति और तीव्रता क्रिस्टल के भीतर परमाणुओं की व्यवस्था पर निर्भर करती है।
- प्रक्रिया:
- क्रिस्टलीकरण: सबसे पहले, शुद्ध प्रोटीन का एक उच्च-क्रम वाला क्रिस्टल उगाना आवश्यक है। यह प्रक्रिया का सबसे कठिन और समय लेने वाला हिस्सा हो सकता है।
- विवर्तन डेटा संग्रह: क्रिस्टल को एक एक्स-रे बीम में रखा जाता है और घुमाया जाता है, जबकि एक डिटेक्टर विवर्तित एक्स-रे को रिकॉर्ड करता है।
- संरचना निर्धारण: जटिल गणितीय गणनाओं (फूरियर ट्रांसफॉर्म) का उपयोग करके, विवर्तन पैटर्न से एक इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र (electron density map) बनाया जाता है। फिर, प्रोटीन की ज्ञात अमीनो एसिड अनुक्रम को इस इलेक्ट्रॉन घनत्व मानचित्र में फिट करके परमाणु मॉडल बनाया जाता है।
- सीमाएँ: इसके लिए उच्च गुणवत्ता वाले क्रिस्टल की आवश्यकता होती है, जो सभी प्रोटीनों (विशेषकर झिल्ली प्रोटीन) के लिए प्राप्त करना मुश्किल होता है। यह एक स्थिर (static) संरचना प्रदान करता है, जो विलयन में प्रोटीन की गतिशीलता को नहीं दर्शाता है।
2. न्यूक्लियर मैग्नेटिक रेजोनेंस (NMR) स्पेक्ट्रोस्कोपी (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy) NMR एक और शक्तिशाली तकनीक है जो विलयन में प्रोटीन की संरचना और गतिशीलता के बारे में जानकारी प्रदान करती है, जो अधिक जैविक रूप से प्रासंगिक स्थिति है।
- सिद्धांत: यह तकनीक कुछ परमाणु नाभिकों (जैसे ¹H, ¹³C, ¹⁵N) के चुंबकीय गुणों पर आधारित है, जिनमें एक गुण होता है जिसे स्पिन (spin) कहते हैं। जब इन नाभिकों वाले प्रोटीन के नमूने को एक मजबूत चुंबकीय क्षेत्र में रखा जाता है, तो नाभिक ऊर्जा के दो स्तरों में संरेखित हो जाते हैं। जब रेडियोफ्रीक्वेंसी (RF) पल्स लागू की जाती है, तो नाभिक उच्च ऊर्जा स्तर पर उत्तेजित हो जाते हैं। पल्स बंद होने पर, वे अपनी मूल अवस्था में लौटते हैं और एक संकेत उत्सर्जित करते हैं। इस संकेत की आवृत्ति नाभिक के स्थानीय रासायनिक वातावरण (यानी, आस-पास के परमाणुओं) पर निर्भर करती है।
- प्रक्रिया:
- नमूना तैयारी: शुद्ध, सांद्रित और घुलनशील प्रोटीन की आवश्यकता होती है, जिसे अक्सर ¹³C और ¹⁵N जैसे स्थिर समस्थानिकों से लेबल किया जाता है।
- डेटा संग्रह: विभिन्न प्रकार के 2-डी और 3-डी NMR प्रयोग किए जाते हैं, जो विभिन्न नाभिकों के बीच सहसंबंध दिखाते हैं।
- संरचना निर्धारण: न्यूक्लियर ओवरहॉसर इफेक्ट (NOE) जैसे प्रयोगों से नाभिकों के बीच की दूरी (5 Å तक) की जानकारी मिलती है। इन दूरी की बाधाओं (distance constraints) का उपयोग करके, कम्प्यूटेशनल एल्गोरिदम प्रोटीन की 3-डी संरचना के संभावित मॉडलों का एक समूह (ensemble) उत्पन्न करते हैं।
- लाभ और सीमाएँ: NMR के लिए क्रिस्टलीकरण की आवश्यकता नहीं होती है और यह विलयन में प्रोटीन की गतिशीलता और अंतःक्रियाओं का अध्ययन कर सकता है। हालांकि, यह आम तौर पर छोटे प्रोटीनों (आमतौर पर < 30 kDa) तक सीमित है और इसके लिए उच्च प्रोटीन सांद्रता की आवश्यकता होती है।
Q6. (क) प्रोटीन वलन में दोष पर संक्षिप्त टिप्पणी लिखिए। (ख) जैविक डाटाबेस क्या होते हैं ? द्वितीयक प्रोटीन अनुक्रमण डेटाबेस की व्याख्या कीजिए।
Ans.
(क) प्रोटीन वलन में दोष (Defects in Protein Folding)
प्रोटीन वलन (folding) वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा एक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला अपनी जैविक रूप से क्रियाशील, त्रि-आयामी (3-D) संरचना प्राप्त करती है। यह एक अत्यंत सटीक और आवश्यक प्रक्रिया है। प्रोटीन वलन में दोष तब उत्पन्न होते हैं जब एक प्रोटीन सही ढंग से वलित होने में विफल रहता है, जिससे वह या तो अपनी सामान्य क्रिया खो देता है या एक विषाक्त (toxic) गुण प्राप्त कर लेता है।
मिसफोल्डिंग और एग्रीगेशन:
गलत तरीके से वलित (misfolded) प्रोटीन अक्सर अस्थिर होते हैं और उनकी हाइड्रोफोबिक सतहें उजागर हो जाती हैं। ये उजागर सतहें उन्हें एक-दूसरे से चिपकने और अघुलनशील समुच्चय (insoluble aggregates) बनाने के लिए प्रेरित करती हैं। ये समुच्चय कोशिकाओं के भीतर या बाहर जमा हो सकते हैं, जिससे सेलुलर कार्यप्रणाली बाधित होती है और अंततः कोशिका मृत्यु हो सकती है।
प्रोटीन फोल्डिंग रोग (प्रोटीनोपैथीज):
कई मानव रोग प्रोटीन के गलत वलन और एकत्रीकरण से जुड़े होते हैं, जिन्हें “प्रोटीनोपैथीज” या “एमाइलॉयडोसेस” कहा जाता है।
- अल्जाइमर रोग (Alzheimer’s Disease): इस न्यूरोडीजेनेरेटिव रोग में, एमाइलॉयड-बीटा (Aβ) पेप्टाइड और टाऊ (Tau) प्रोटीन गलत तरीके से वलित होकर क्रमशः मस्तिष्क में अघुलनशील प्लाक (plaques) और टेंगल (tangles) बनाते हैं। यह न्यूरॉनल मृत्यु का कारण बनता है।
- पार्किंसंस रोग (Parkinson’s Disease): इसमें अल्फा-साइन्यूक्लिन (α-synuclein) प्रोटीन का गलत वलन और एकत्रीकरण होता है, जो न्यूरॉन्स के भीतर लेवी बॉडीज (Lewy bodies) नामक संरचनाएं बनाता है।
- प्रियन रोग (Prion Diseases): ये संक्रामक रोग हैं, जैसे कि क्रुट्ज़फेल्ड-जैकब रोग (CJD)। ये प्रियन प्रोटीन (PrP) के गलत वलन के कारण होते हैं। गलत वलित PrP (जिसे PrPSc कहा जाता है) सामान्य PrP (PrPC) को भी अपनी तरह गलत वलित होने के लिए प्रेरित कर सकता है, जिससे एक श्रृंखला अभिक्रिया शुरू हो जाती है।
- सिस्टिक फाइब्रोसिस (Cystic Fibrosis): यह एक आनुवंशिक रोग है जिसमें CFTR प्रोटीन में एक उत्परिवर्तन के कारण वह गलत तरीके से वलित हो जाता है और कोशिका की सतह तक पहुंचने से पहले ही एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में नष्ट हो जाता है। इससे क्लोराइड आयन परिवहन में दोष उत्पन्न होता है।
कोशिकाओं में चैपेरोन (chaperones) नामक प्रोटीन होते हैं जो सही वलन में सहायता करते हैं और गलत वलित प्रोटीनों को फिर से वलित करने या उन्हें नष्ट करने में मदद करते हैं। हालांकि, उम्र बढ़ने या तनाव की स्थितियों में यह सुरक्षा प्रणाली विफल हो सकती है, जिससे रोगों का खतरा बढ़ जाता है।
(ख) जैविक डाटाबेस और द्वितीयक प्रोटीन अनुक्रमण डेटाबेस
जैविक डाटाबेस (Biological Databases):
जैविक डाटाबेस कंप्यूटर-आधारित संग्रह हैं जो जैविक डेटा, जैसे न्यूक्लिक एसिड अनुक्रम, प्रोटीन अनुक्रम, संरचनाएं, और कार्य, को एक संगठित और खोजने योग्य प्रारूप में संग्रहीत करते हैं। ये डाटाबेस जैव सूचना विज्ञान (bioinformatics) में अनुसंधान के लिए मौलिक उपकरण हैं। इन्हें मोटे तौर पर वर्गीकृत किया जा सकता है:
- प्राथमिक डाटाबेस (Primary Databases): ये सीधे प्रयोगात्मक परिणामों से प्राप्त कच्चे डेटा (जैसे डीएनए या प्रोटीन अनुक्रम) को संग्रहीत करते हैं। उदाहरण: GenBank (न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम) और UniProtKB/Swiss-Prot (प्रोटीन अनुक्रम)।
- द्वितीयक डाटाबेस (Secondary Databases): ये प्राथमिक डाटाबेस में मौजूद डेटा के विश्लेषण से प्राप्त क्यूरेटेड और व्युत्पन्न जानकारी प्रदान करते हैं।
द्वितीयक प्रोटीन अनुक्रमण डेटाबेस (Secondary Protein Sequence Databases):
द्वितीयक डाटाबेस केवल कच्चे अनुक्रम को संग्रहीत करने के बजाय, अनुक्रमों के बीच संबंधों और पैटर्न पर ध्यान केंद्रित करते हैं। वे प्राथमिक अनुक्रम डेटा से कम्प्यूटेशनल रूप से प्राप्त जानकारी को व्यवस्थित करते हैं। यह शोधकर्ताओं को एक अज्ञात प्रोटीन के संभावित कार्य, संरचना या परिवार की भविष्यवाणी करने में मदद करता है।
ये डाटाबेस विभिन्न प्रकार की जानकारी संग्रहीत करते हैं, जैसे:
- अनुक्रम मोटिफ्स (Sequence Motifs): छोटे, संरक्षित अनुक्रम पैटर्न जो अक्सर एक विशिष्ट कार्य से जुड़े होते हैं (जैसे, एक फॉस्फोराइलेशन साइट)।
- संरचनात्मक डोमेन (Structural Domains): एक प्रोटीन के वे हिस्से जो स्वतंत्र रूप से वलित होते हैं और अक्सर एक विशिष्ट कार्य करते हैं।
- प्रोटीन परिवार (Protein Families): विकासवादी रूप से संबंधित प्रोटीनों के समूह।
प्रमुख द्वितीयक प्रोटीन डाटाबेस के उदाहरण:
- PROSITE: यह प्रोटीन परिवारों और डोमेन की पहचान करने के लिए जैविक रूप से महत्वपूर्ण पैटर्न और प्रोफाइल का एक संग्रह है। एक पैटर्न एक छोटा, गुणात्मक रूप से निर्धारित अनुक्रम मोटिफ होता है, जबकि एक प्रोफाइल एक मात्रात्मक मोटिफ होता है जो एक संरक्षित क्षेत्र में प्रत्येक स्थिति में अमीनो एसिड की घटना की आवृत्ति का वर्णन करता है।
- Pfam (Protein families): यह प्रोटीन डोमेन परिवारों का एक बड़ा संग्रह है। Pfam में प्रत्येक परिवार को कई अनुक्रम संरेखण (multiple sequence alignments) और हिडन मार्कोव मॉडल (Hidden Markov Models – HMMs) द्वारा दर्शाया गया है। यह एक अनुक्रम में डोमेन की पहचान करने के लिए एक बहुत ही संवेदनशील और व्यापक उपकरण है।
- PRINTS: यह प्रोटीन परिवारों के लक्षण वर्णन के लिए “फिंगरप्रिंट” का एक संग्रह है। एक फिंगरप्रिंट कई संरक्षित मोटिफ्स का एक समूह होता है जो एक साथ मिलकर एक प्रोटीन परिवार की पहचान करते हैं। यह एकल मोटिफ की तुलना में अधिक विशिष्टता प्रदान करता है।
- InterPro: यह एक एकीकृत डाटाबेस है जो PROSITE, Pfam, PRINTS और कई अन्य द्वितीयक डाटाबेस से जानकारी को एक साथ लाता है, जिससे प्रोटीन विश्लेषण के लिए एक व्यापक संसाधन उपलब्ध होता है।
Q7. निम्नलिखित में से किन्हीं दो का वर्णन कीजिए : (क) ऑक्सीजन बंधुता वक्र (ख) क्लोराइड शिफ्ट की क्रियाविधि (ग) रेशेदार प्रोटीन
Ans.
(क) ऑक्सीजन बंधुता वक्र (Oxygen Binding Curves)
ऑक्सीजन बंधुता वक्र एक ग्राफ है जो दर्शाता है कि मायोग्लोबिन और हीमोग्लोबिन जैसे प्रोटीन की ऑक्सीजन के साथ संतृप्ति (saturation) ऑक्सीजन के आंशिक दाब (partial pressure, pO₂) के साथ कैसे बदलती है। यह वक्र प्रोटीन की ऑक्सीजन के प्रति बंधुता (affinity) को दर्शाता है।
मायोग्लोबिन (Myoglobin):
- मायोग्लोबिन, जो मांसपेशियों में पाया जाता है, में एक हीम समूह वाली एक एकल पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला होती है।
- इसका ऑक्सीजन बंधुता वक्र एक अतिपरवलयिक (hyperbolic) आकार का होता है।
- यह इंगित करता है कि मायोग्लोबिन बहुत कम pO₂ पर भी ऑक्सीजन को कसकर बांधता है। इसकी ऑक्सीजन के प्रति बहुत अधिक और स्थिर बंधुता होती है।
- इसका P₅₀ (वह pO₂ जिस पर 50% प्रोटीन संतृप्त होता है) बहुत कम (लगभग 1 mm Hg) होता है।
- यह गुण इसे मांसपेशियों में ऑक्सीजन के भंडारण के लिए आदर्श बनाता है, जहां यह आराम की स्थिति में ऑक्सीजन को बांधता है और व्यायाम के दौरान जब pO₂ बहुत कम हो जाता है, तब इसे छोड़ता है।
हीमोग्लोबिन (Hemoglobin):
- हीमोग्लोबिन, जो लाल रक्त कोशिकाओं में पाया जाता है, एक टेट्रामर है जिसमें चार पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं (आमतौर पर दो अल्फा और दो बीटा) होती हैं, प्रत्येक में एक हीम समूह होता है।
- इसका ऑक्सीजन बंधुता वक्र एक सिग्माभ (sigmoidal) या ‘S’ आकार का होता है।
- यह ‘S’ आकार सहकारी बंधन (cooperative binding) का परिणाम है। जब एक ऑक्सीजन अणु हीमोग्लोबिन के एक हीम समूह से जुड़ता है, तो यह प्रोटीन की संरचना में एक परिवर्तन को प्रेरित करता है जिससे शेष खाली हीम समूहों की ऑक्सीजन के प्रति बंधुता बढ़ जाती है। इसी तरह, एक ऑक्सीजन अणु का निकलना शेष अणुओं के निकलने को आसान बनाता है।
- इस सहकारिता के कारण, हीमोग्लोबिन फेफड़ों में उच्च pO₂ (लगभग 100 mm Hg) पर कुशलता से ऑक्सीजन को बांध सकता है और ऊतकों में कम pO₂ (लगभग 20-40 mm Hg) पर इसे छोड़ सकता है।
- इसका P₅₀ लगभग 26 mm Hg होता है, जो इसे एक प्रभावी ऑक्सीजन ट्रांसपोर्टर बनाता है।
- हीमोग्लोबिन की बंधुता को H⁺, CO₂, और 2,3-बिसफॉस्फोग्लिसरेट (2,3-BPG) जैसे एलोस्टेरिक प्रभावकों द्वारा भी नियंत्रित किया जाता है (बोहर प्रभाव)।
संक्षेप में, मायोग्लोबिन का अतिपरवलयिक वक्र भंडारण कार्य को दर्शाता है, जबकि हीमोग्लोबिन का सिग्माभ वक्र इसके कुशल परिवहन कार्य को दर्शाता है।
(ख) क्लोराइड शिफ्ट की क्रियाविधि (Mechanism of Chloride Shift)
क्लोराइड शिफ्ट, जिसे हैमबर्गर परिघटना (Hamburger phenomenon) भी कहा जाता है, एक प्रक्रिया है जो लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) में होती है और रक्त में कार्बन डाइऑक्साइड (CO₂) के परिवहन में एक महत्वपूर्ण भूमिका निभाती है। यह RBC झिल्ली के पार बाइकार्बोनेट (HCO₃⁻) और क्लोराइड (Cl⁻) आयनों का आदान-प्रदान है।
क्रियाविधि के चरण:
- ऊतकों में CO₂ उत्पादन: चयापचय करने वाले ऊतक CO₂ का उत्पादन करते हैं, जो रक्त प्लाज्मा में और फिर लाल रक्त कोशिकाओं में विसरित होता है।
- कार्बोनिक एसिड का निर्माण: RBC के भीतर, एंजाइम कार्बोनिक एनहाइड्रेज (carbonic anhydrase) बहुत तेजी से CO₂ और पानी (H₂O) को कार्बोनिक एसिड (H₂CO₃) में परिवर्तित करता है। CO₂ + H₂O ⇌ H₂CO₃
- बाइकार्बोनेट और प्रोटॉन में विघटन: कार्बोनिक एसिड एक अस्थिर अणु है और तुरंत एक बाइकार्बोनेट आयन (HCO₃⁻) और एक प्रोटॉन (H⁺) में विघटित हो जाता है। H₂CO₃ ⇌ H⁺ + HCO₃⁻
- बाइकार्बोनेट का निकास: जैसे ही RBC के भीतर HCO₃⁻ की सांद्रता बढ़ती है, यह कोशिका से बाहर प्लाज्मा में चला जाता है। यह परिवहन बैंड 3 प्रोटीन (Band 3 protein) नामक एक एंटीपोर्टर के माध्यम से होता है, जिसे क्लोराइड-बाइकार्बोनेट एक्सचेंजर भी कहा जाता है।
- क्लोराइड का प्रवेश (शिफ्ट): RBC की विद्युत उदासीनता (electrical neutrality) बनाए रखने के लिए, प्रत्येक HCO₃⁻ आयन के बाहर जाने पर, एक क्लोराइड आयन (Cl⁻) प्लाज्मा से RBC के भीतर चला जाता है। इसी आयन विनिमय को क्लोराइड शिफ्ट कहा जाता है।
महत्व:
- यह तंत्र CO₂ को उसके सबसे घुलनशील रूप, बाइकार्बोनेट आयन, के रूप में रक्त प्लाज्मा में ले जाने की अनुमति देता है। लगभग 70% CO₂ इसी तरह से परिवहित होता है।
- यह रक्त के pH बफरिंग सिस्टम में भी योगदान देता है। RBC के भीतर उत्पन्न H⁺ आयन हीमोग्लोबिन से बंध जाते हैं, जो हीमोग्लोबिन की ऑक्सीजन के प्रति बंधुता को कम करता है (बोहर प्रभाव) और ऊतकों में ऑक्सीजन की रिहाई को बढ़ावा देता है।
फेफड़ों में, यह प्रक्रिया उलट जाती है: Cl⁻ बाहर निकलता है, HCO₃⁻ अंदर आता है, CO₂ में परिवर्तित होता है, और फिर बाहर निकाल दिया जाता है।
Q8. (क) माँसपेशी संकुचन में कैल्शियम और ए.टी.पी. की भूमिका का विवरण दीजिए। (ख) मायोग्लोबिन और हीमोग्लोबिन के बीच अन्तर स्पष्ट कीजिए।
Ans.
(क) मांसपेशी संकुचन में कैल्शियम (Ca²⁺) और ए.टी.पी. (ATP) की भूमिका
मांसपेशी संकुचन स्लाइडिंग फिलामेंट मॉडल (sliding filament model) द्वारा होता है, जिसमें मोटे (मायोसिन) फिलामेंट पतले (एक्टिन) फिलामेंट के ऊपर सरकते हैं, जिससे सार्कोमियर छोटा हो जाता है। इस प्रक्रिया को कैल्शियम आयनों (Ca²⁺) और एडेनोसिन ट्राइफॉस्फेट (ATP) द्वारा बहुत ही सटीक रूप से नियंत्रित किया जाता है।
ए.टी.पी. (ATP) की भूमिका:
ATP मांसपेशी संकुचन के लिए ऊर्जा का प्रत्यक्ष स्रोत है और इसके दो महत्वपूर्ण कार्य हैं:
- ऊर्जा प्रदान करना (Power Stroke के लिए):
- मायोसिन के सिर (head) पर एक ATP-बाइंडिंग साइट और एक ATPase (ATP को तोड़ने वाला एंजाइम) गतिविधि होती है।
- जब ATP मायोसिन सिर से जुड़ता है, तो मायोसिन एक्टिन से अलग हो जाता है।
- फिर, मायोसिन सिर पर मौजूद ATPase, ATP को ADP और अकार्बनिक फॉस्फेट (Pi) में हाइड्रोलाइज करता है। इस हाइड्रोलिसिस से निकली ऊर्जा मायोसिन सिर को “सक्रिय” या “कॉक” (cocked) अवस्था में ले जाती है, जिससे यह उच्च-ऊर्जा विन्यास में आ जाता है।
- यह सक्रिय मायोसिन सिर अब एक्टिन पर एक बाइंडिंग साइट से जुड़ सकता है, जिससे एक क्रॉस-ब्रिज बनता है।
- इसके बाद, Pi और फिर ADP का निकलना मायोसिन सिर को अपनी मूल, निम्न-ऊर्जा अवस्था में वापस लौटने का कारण बनता है। इस प्रक्रिया को पावर स्ट्रोक (power stroke) कहा जाता है, जिसमें मायोसिन सिर एक्टिन फिलामेंट को सार्कोमियर के केंद्र की ओर खींचता है, जिससे संकुचन होता है।
- मायोसिन को एक्टिन से अलग करना:
- पावर स्ट्रोक के बाद, मायोसिन सिर एक्टिन से मजबूती से जुड़ा रहता है (जिसे रिगर अवस्था कहते हैं)।
- एक नया ATP अणु जब मायोसिन सिर से जुड़ता है, तो यह एक्टिन और मायोसिन के बीच के बंधन को कमजोर कर देता है, जिससे मायोसिन सिर एक्टिन से अलग हो जाता है।
- इसके बाद संकुचन का चक्र फिर से शुरू हो सकता है। ATP की अनुपस्थिति में, मायोसिन एक्टिन से अलग नहीं हो पाता, जिससे कठोरता (rigor mortis) की स्थिति उत्पन्न होती है।
कैल्शियम (Ca²⁺) की भूमिका:
कैल्शियम आयन एक नियामक स्विच के रूप में कार्य करते हैं, जो यह निर्धारित करता है कि संकुचन कब शुरू और समाप्त होगा।
- आराम की स्थिति में: जब मांसपेशी आराम कर रही होती है, तो Ca²⁺ की सांद्रता साइटोसोल में बहुत कम होती है क्योंकि इसे सार्कोप्लाज्मिक रेटिकुलम (SR) में सक्रिय रूप से पंप किया जाता है। इस स्थिति में, ट्रोपोमायोसिन (tropomyosin) नामक एक नियामक प्रोटीन एक्टिन फिलामेंट पर मायोसिन-बाइंडिंग साइट्स को ढके रहता है, जिससे क्रॉस-ब्रिज बनने से रोकता है।
- संकुचन के दौरान:
- जब एक तंत्रिका आवेग (एक्शन पोटेंशिअल) मांसपेशी कोशिका तक पहुंचता है, तो यह SR से साइटोसोल में Ca²⁺ की बड़ी मात्रा में रिहाई को ट्रिगर करता है।
- जारी किया गया Ca²⁺ एक अन्य नियामक प्रोटीन, ट्रोपोनिन (troponin) (विशेष रूप से इसके Troponin C सबयूनिट) से जुड़ता है।
- Ca²⁺ के ट्रोपोनिन से जुड़ने से ट्रोपोनिन-ट्रोपोमायोसिन कॉम्प्लेक्स की संरचना में बदलाव आता है।
- यह संरचनात्मक परिवर्तन ट्रोपोमायोसिन को एक्टिन फिलामेंट पर मायोसिन-बाइंडिंग साइट्स से दूर खींच लेता है, जिससे ये साइटें उजागर हो जाती हैं।
- अब सक्रिय मायोसिन सिर इन उजागर साइटों से जुड़ सकते हैं, और ATP द्वारा संचालित संकुचन चक्र शुरू हो सकता है।
- शिथिलन (Relaxation): जब तंत्रिका उत्तेजना समाप्त हो जाती है, तो Ca²⁺ को ATP-निर्भर पंपों द्वारा वापस SR में सक्रिय रूप से पंप कर दिया जाता है। साइटोसोलिक Ca²⁺ सांद्रता में गिरावट के कारण Ca²⁺ ट्रोपोनिन से अलग हो जाता है, ट्रोपोमायोसिन वापस बाइंडिंग साइट्स को ढक लेता है, और मांसपेशी शिथिल हो जाती है।
(ख) मायोग्लोबिन और हीमोग्लोबिन के बीच अंतर
मायोग्लोबिन और हीमोग्लोबिन दोनों हीम-युक्त प्रोटीन हैं जो ऑक्सीजन से बंधते हैं, लेकिन उनकी संरचना, कार्य और स्थान में महत्वपूर्ण अंतर हैं।
गुण
मायोग्लोबिन (Myoglobin)
हीमोग्लोबिन (Hemoglobin)
संरचना
एक एकलक (monomer) है; इसमें एक पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला और एक हीम समूह होता है।
एक चतुर्लक (tetramer) है; इसमें चार पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाएं (आमतौर पर 2 अल्फा, 2 बीटा) और चार हीम समूह होते हैं।
स्थान
मुख्य रूप से मांसपेशी ऊतक (विशेषकर हृदय और कंकाल की मांसपेशियों) में पाया जाता है।
लाल रक्त कोशिकाओं (RBCs) में पाया जाता है।
प्राथमिक कार्य
मांसपेशियों में ऑक्सीजन का भंडारण (storage) करना।
फेफड़ों से ऊतकों तक ऑक्सीजन का परिवहन (transport) करना।
ऑक्सीजन बंधुता (Affinity)
ऑक्सीजन के प्रति बहुत अधिक और स्थिर बंधुता होती है। यह कम ऑक्सीजन दबाव पर भी ऑक्सीजन को कसकर बांधता है।
ऑक्सीजन के प्रति परिवर्तनीय (variable) बंधुता होती है। यह फेफड़ों में उच्च बंधुता और ऊतकों में कम बंधुता दिखाता है।
ऑक्सीजन बंधुता वक्र
अतिपरवलयिक (Hyperbolic) ।
सिग्माभ (Sigmoidal) या ‘S’ आकार का, जो सहकारी बंधन को दर्शाता है।
बंधन का प्रकार
गैर-सहकारी (Non-cooperative); एक ही बंधन स्थल होता है।
सहकारी (Cooperative) ; एक ऑक्सीजन अणु का बंधन अन्य स्थलों की बंधुता को बढ़ाता है।
एलोस्टेरिक नियमन
एलोस्टेरिक रूप से नियंत्रित नहीं होता है।
H⁺ (pH), CO₂, और 2,3-BPG जैसे एलोस्टेरिक प्रभावकों द्वारा नियंत्रित होता है (बोहर प्रभाव)।
P₅₀ मान
बहुत कम (लगभग 1 mm Hg), जो उच्च बंधुता को इंगित करता है।
अधिक (लगभग 26 mm Hg), जो कम समग्र बंधुता और कुशल रिलीज को इंगित करता है।
IGNOU BBCCT-105 Previous Year Solved Question Paper in English
Q1. (a) Enlist the characteristics of proteins. Describe them in detail. (b) Differentiate between homogenization and ultrasonication and explain with suitable example.
Ans. (a) Characteristics of Proteins Proteins are complex, high molecular weight macromolecules composed of amino acids. Their key characteristics are as follows:
- Molecular Weight: Proteins have very high molecular weights, ranging from a few thousand to several million daltons. This depends on the number and type of amino acids present in the protein.
- Amphoteric Nature: Proteins contain both amino and carboxyl groups, hence they act as amphoteric compounds. They can react with both acids and bases. The pH at which the net charge on the protein is zero is called the isoelectric point (pI) .
- Structural Levels: Proteins have four levels of structure:
- Primary Structure: The linear sequence of amino acids in the polypeptide chain.
- Secondary Structure: The local folding of the polypeptide backbone, leading to structures like the alpha-helix (α-helix) and beta-sheet (β-sheet) .
- Tertiary Structure: The overall 3-D folding of a single polypeptide chain.
- Quaternary Structure: The assembly of multiple polypeptide chains (subunits).
- Denaturation: When proteins are exposed to extreme conditions like high heat, changes in pH, or chemical agents, their tertiary and secondary structures are disrupted. This process, called denaturation, leads to the loss of the protein’s biological activity.
- Solubility: The solubility of a protein is lowest at its isoelectric point (pI), where it can be easily precipitated. The concentration of salts also affects solubility; low concentrations increase solubility (salting in) while high concentrations decrease it (salting out).
- Biological Activity: Each protein has a specific function, which is determined by its unique 3-D structure. They function as enzymes, hormones, antibodies, and structural components.
(b) Difference between Homogenization and Ultrasonication
Homogenization and ultrasonication are both methods of cell disruption used to release intracellular components (like proteins) from cells or tissues. However, they differ in their principle and application.
Homogenization:
- Principle: This is a mechanical method that uses shearing forces to break open cells. The sample is forced through a narrow space, causing the cells to rupture.
- Procedure: It typically involves a special apparatus called a homogenizer.
- Example 1: Dounce homogenizer: This consists of a glass tube and a tightly fitting pestle. The tissue is ground by moving the pestle up and down, lysing the cells. It is suitable for soft tissues like mammalian cells.
- Example 2: Potter-Elvehjem homogenizer: Similar to the Dounce but features a Teflon pestle and can be driven by a motor, making it more effective for tougher tissues.
- Characteristics: It is good for large sample volumes and often generates less heat, which helps in preserving heat-sensitive proteins.
Ultrasonication:
- Principle: This method uses high-frequency sound waves (typically >20 kHz). These waves create rapid pressure changes in the liquid, leading to the formation and collapse of microscopic bubbles. This process is called cavitation . The shock waves generated by the collapsing bubbles disrupt nearby cells.
- Procedure: An instrument called a sonicator is used, which has a titanium probe that vibrates at high frequency and is immersed directly into the sample suspension.
- Example: Using a sonic probe to break open cells with tough cell walls, such as bacteria or yeast.
- Characteristics: It is very effective and rapid, especially for microbial cells. However, it can generate significant heat, so it is crucial to keep the sample cool (e.g., on ice) to prevent protein denaturation.
Key Differences:
| Property | Homogenization | Ultrasonication |
|---|---|---|
| Working Principle | Mechanical shear | Sound-induced cavitation |
| Apparatus | Homogenizer (e.g., Dounce) | Sonicator |
| Suitability | Soft tissues and cells | Tough cell walls (e.g., bacteria, yeast) |
| Heat Generation | Generally low | High, requires cooling |
Q2. Write short notes on the following : (a) Biuret test (b) Lyophilisation (c) Ion exchange chromatography (d) Paper chromatography
Ans. (a) Biuret test The Biuret test is a qualitative biochemical test used to detect the presence of peptide bonds in a protein. Its principle is that in an alkaline medium, compounds with two or more peptide bonds react with copper sulfate (CuSO₄) to form a violet-colored complex. The reaction requires at least two peptide bonds, hence the test does not give a positive result for free amino acids or dipeptides. The test is named after the biuret molecule (NH₂-CO-NH-CO-NH₂), which gives a positive result. The procedure involves first adding a strong base like sodium hydroxide (NaOH) to the test solution, followed by an aqueous solution of copper sulfate. The intensity of the violet color is proportional to the protein concentration, so it can also be used for quantitative estimation of proteins.
(b) Lyophilisation Lyophilisation, also known as freeze-drying , is a dehydration process used to preserve heat-sensitive materials like proteins, vaccines, and pharmaceuticals. The process involves converting water directly from a solid state (ice) to a gaseous state (vapor), a process called sublimation . It has three main stages:
- Freezing: The product is rapidly frozen to a temperature below its triple point to avoid the formation of large ice crystals that can damage the cellular structure.
- Primary Drying: The pressure is reduced to a very low level, and a small amount of heat is supplied to allow the ice to sublimate. About 95% of the water is removed in this stage.
- Secondary Drying: The temperature is raised slightly while the pressure remains low to remove the remaining adsorbed water.
The final product is a dry, porous powder that is easily reconstituted and remains stable for long periods at room temperature.
(c) Ion exchange chromatography Ion exchange chromatography (IEC) is a powerful purification technique that separates molecules based on their net charge . The principle is that charged molecules bind to a stationary phase of the opposite charge. The stationary phase is a resin or matrix to which ionic functional groups are attached.
- Cation Exchange: The stationary phase is negatively charged (e.g., carboxymethyl group) and binds positively charged molecules (cations).
- Anion Exchange: The stationary phase is positively charged (e.g., DEAE – diethylaminoethyl) and binds negatively charged molecules (anions).
In the process, a protein mixture is passed through a column containing the ion-exchange resin. At a chosen pH, proteins with a net charge opposite to the resin will bind, while others will flow through. The bound proteins are later eluted by either changing the pH or using a salt gradient. The salt ions compete with the proteins for binding to the resin, displacing them.
(d) Paper chromatography Paper chromatography is an analytical technique used to separate the components of a mixture. It is a type of partition chromatography . Here, the stationary phase is a special type of paper (cellulose) with water adsorbed onto it, and the mobile phase is an organic solvent. The principle is that the components of the mixture move at different rates based on their differential solubility and adsorption between the stationary and mobile phases. In the procedure, a small spot of the sample mixture is applied to a baseline on the paper. The edge of the paper is then dipped into a solvent in a closed chamber. The solvent moves up the paper by capillary action, carrying the sample with it. Components that are more soluble and less adsorbed move faster. After separation, the distance traveled by each component is measured and the retention factor (Rf value) is calculated: Rf = Distance traveled by the component / Distance traveled by the solvent The Rf value is a characteristic of a compound in a given solvent system.
Q3. (a) Explain 2-D gel electrophoresis. Enlist the applications of electrophoresis. (b) What is protein sequencing ? Describe Edman degradation method of protein sequencing.
Ans. (a) 2-D Gel Electrophoresis Two-dimensional (2-D) gel electrophoresis is a powerful protein separation technique that separates a mixture of proteins based on two different physical properties. It offers much higher resolution than conventional SDS-PAGE. It consists of two steps: 1. First Dimension: Isoelectric Focusing (IEF) In this step, proteins are separated based on their isoelectric point (pI) . The protein mixture is loaded onto a thin strip gel that contains a stable pH gradient. When an electric field is applied, proteins migrate towards the pH that is equal to their pI.
- At pH < pI, the protein is positively charged and moves towards the cathode (negative electrode).
- At pH > pI, the protein is negatively charged and moves towards the anode (positive electrode).
A protein migrates until it reaches the point in the gel where the pH equals its pI. At this point, the protein has a net charge of zero and stops moving in the electric field. The proteins are thus focused in the gel according to their pI values.
2. Second Dimension: SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) The IEF strip is then placed on top of an SDS-PAGE slab gel. SDS is an anionic detergent that denatures the proteins and coats them with a uniform negative charge, proportional to their mass. Now, when a second electric field is applied perpendicular to the IEF strip, the proteins migrate out of the IEF strip and into the SDS-PAGE gel. In this gel, the proteins are separated solely based on their molecular weight . Smaller proteins move faster, while larger proteins are retarded by the gel matrix and move slower. The final result is a 2-D gel on which proteins appear as spots, where each spot represents a specific protein positioned according to its unique pI (x-axis) and molecular weight (y-axis).
Applications of Electrophoresis:
- Protein Separation and Purification: Isolating individual proteins from a mixture.
- Determination of Molecular Weight: Estimating the molecular weight of unknown proteins.
- Proteomics: 2-D gel electrophoresis is used to analyze the entire set of proteins expressed in a cell or tissue (the proteome).
- Disease Diagnosis: Identifying specific proteins (biomarkers) associated with diseases.
- Comparative Analysis of Protein Expression: Studying changes in protein expression levels under different conditions (e.g., healthy vs. diseased).
- Nucleic Acid Analysis: Separating DNA and RNA fragments according to their size (e.g., in agarose gel electrophoresis).
(b) Protein Sequencing and Edman Degradation
Protein Sequencing
is the process of determining the sequence of amino acids (the primary structure) in a protein or polypeptide. The function of a protein is highly dependent on its specific amino acid sequence, which in turn determines its 3-D structure.
Edman Degradation Method: The Edman degradation is the most widely used method for determining the sequence of amino acids from the N-terminus of a protein. It was developed by Pehr Edman. It is a cyclic process where the N-terminal amino acid of a polypeptide chain is removed and identified in each cycle.
The main steps of the process are: 1. Coupling: The polypeptide is reacted with phenylisothiocyanate (PITC) in a mildly alkaline medium (pH ~9.0). PITC reacts with the uncharged N-terminal α-amino group of the polypeptide chain to form a phenylthiocarbamoyl (PTC) derivative. (PITC + N-terminal amino acid) → PTC-polypeptide
2. Cleavage: Next, the reaction is treated with a strong anhydrous acid, such as trifluoroacetic acid (TFA). This acid selectively cleaves the peptide bond between the N-terminal residue and the rest of the polypeptide chain. This releases the N-terminal amino acid as a thiazolinone derivative. The remaining polypeptide chain is now one amino acid shorter and ready for the next cycle. (PTC-polypeptide + TFA) → Thiazolinone-amino acid + Polypeptide (n-1)
3. Conversion and Identification: The unstable thiazolinone derivative is converted into a more stable phenylthiohydantoin (PTH) derivative by heating with an aqueous acid. (Thiazolinone-amino acid + H⁺) → PTH-amino acid This PTH-amino acid is then identified by chromatography, typically HPLC (High-Performance Liquid Chromatography). Each amino acid has its own characteristic PTH derivative, which can be identified by comparison with known standards.
This process is repeated iteratively, allowing the sequence of the polypeptide to be determined one by one from the N-terminus. Automated sequencers, also called Edman sequencers, can efficiently carry out this process for up to 30-60 residues.
Q4. (a) Enumerate the principle and components of mass spectrometry. (b) Illustrate the following : (i) Endopeptidases and Exopeptidases (ii) Agarose gel matrix
Ans. (a) Principle and Components of Mass Spectrometry Principle: Mass Spectrometry (MS) is a powerful analytical technique used to measure the mass-to-charge ratio (m/z) of molecules. It is a vital tool in proteomics for the identification and characterization of proteins and peptides. The basic principle of MS is based on three steps:
- Ionization: The molecules of the sample (analyte) are converted into gas-phase ions. For protein analysis, soft ionization techniques like Electrospray Ionization (ESI) and Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) are used to ionize large molecules without fragmenting them.
- Separation: The generated ions are accelerated into an electric and/or magnetic field and sent into a mass analyzer. The mass analyzer separates these ions based on their m/z ratio. Ions with different m/z values follow different paths or speeds in the field.
- Detection: The separated ions strike a detector, which generates a signal. The relative abundance of ions at each m/z value is measured. The result is presented as a mass spectrum, which is a graph of ion intensity versus m/z.
Components: A typical mass spectrometer consists of the following main components:
- Sample Inlet: This introduces the sample into the instrument. It can be directly coupled to a chromatography system (like HPLC).
- Ion Source: This is where the sample is ionized. MALDI and ESI are the most common sources for proteins.
- MALDI: The sample is mixed with a matrix and ionized by a laser pulse. It primarily creates singly charged ions.
- ESI: The sample solution is sprayed through a high-voltage capillary, creating multiply-charged ions.
- Mass Analyzer: This is the “heart” of the instrument, between the ion source and the detector. It separates ions based on their m/z. Common types include Time-of-Flight (TOF) , Quadrupole , and Ion Trap .
- Detector: This records the separated ions and measures their abundance. It converts the impact of the ions into an electrical signal, which is then processed.
- Vacuum System: The entire instrument (except for the ion source) is kept under a high vacuum to allow the ions to travel freely without colliding with other molecules.
(b) Illustration of the following (i) Endopeptidases and Exopeptidases Peptidases (or proteases) are enzymes that cleave peptide bonds. They can be classified into two main groups based on their site of action:
Endopeptidases: These enzymes cleave specific peptide bonds within a polypeptide chain. They do not act on the terminal ends. Their action breaks large polypeptides into smaller peptides. They often recognize specific amino acid sequences.
- Example 1: Trypsin: A digestive enzyme that cleaves peptide bonds on the carboxyl side of lysine (Lys) and arginine (Arg).
- Example 2: Chymotrypsin: Cleaves bonds on the carboxyl side of large hydrophobic amino acids like phenylalanine (Phe), tryptophan (Trp), and tyrosine (Tyr).
Illustration:
…-Ala-Gly-
Lys
-|-
Ala
-Pro-Phe-…. (Trypsin will cut after ‘Lys’)
Exopeptidases: These enzymes remove amino acids one at a time from the ends (termini) of a polypeptide chain.
- Aminopeptidases: These remove amino acids from the N-terminus (amino end).
- Carboxypeptidases: These remove amino acids from the C-terminus (carboxyl end).
- Example: Carboxypeptidase A: Removes C-terminal aromatic or aliphatic amino acids.
Illustration:
NH₂-
Ala
-Gly-Lys-Ala-Pro-
Phe
-COOH
- An aminopeptidase would remove ‘Ala’.
- A carboxypeptidase would remove ‘Phe’.
(ii) Agarose Gel Matrix Agarose is a natural polysaccharide obtained from seaweed. It is a linear polymer of galactose. When agarose powder is heated in a buffer and then cooled, it forms a cross-linked, porous gel matrix . This matrix acts as a molecular sieve. Structure and Function: The chains of agarose associate via hydrogen bonds to form a 3-D network of fibers. The spaces between these fibers create pores. The size of these pores depends on the concentration of agarose:
- Low concentration (e.g., 0.7%): Forms large pores, suitable for separating very large molecules (e.g., large DNA fragments).
- High concentration (e.g., 2.0%): Forms small pores, suitable for separating smaller molecules (e.g., small DNA fragments).
When an electric field is applied across this gel (in agarose gel electrophoresis), negatively charged molecules (like DNA, which is negative due to its phosphate backbone) move towards the positive electrode (anode). The molecules migrate through this matrix. Smaller molecules can pass through the pores easily and move quickly, while larger molecules are more entangled in the matrix and move slowly. Thus, the agarose gel separates molecules based on their
size
.
Illustration:
A diagram could show a tangled network of agarose fibers, with pores in between. Small and large molecules could be shown migrating through these pores at different speeds.
Q5. (a) Distinguish between α-helix and β-sheet. (b) Explain any two techniques to study 3-D structure of proteins.
Ans. (a) Distinction between α-helix and β-sheet The α-helix and β-sheet are the two most common types of secondary structure in proteins. They are local, regular folding patterns of the polypeptide backbone stabilized by hydrogen bonds between the C=O and N-H groups of the backbone. The main differences are:
| Property | α-helix (Alpha-helix) | β-sheet (Beta-sheet) |
|---|---|---|
Structure |
A single polypeptide chain forms a right-handed coiled or spring-like structure around an axis. |
One or more segments of the polypeptide chain lie parallel or anti-parallel to each other in a nearly fully extended conformation, forming a pleated sheet-like structure. |
Hydrogen Bonds |
The hydrogen bonds are intramolecular , i.e., formed within the same polypeptide chain. The C=O group of one amino acid (n) bonds with the N-H group of an amino acid four residues ahead (n+4). |
The hydrogen bonds are inter-strand . They can be formed either between different segments of the same chain (intramolecular) or between different polypeptide chains (intermolecular). |
Orientation of R-groups |
The R-groups (side chains) project outward from the helical axis, to avoid steric hindrance. |
The R-groups are directed alternately above and below the plane of the sheet. |
Bonding relative to axis |
Hydrogen bonds are roughly parallel to the helical axis. |
Hydrogen bonds are perpendicular to the direction of the strands. |
Examples |
α-keratin found in hair and wool, helical segments in myoglobin and hemoglobin. |
Silk fibroin found in silk, β-barrel structures in antibodies. |
(b) Two Techniques to Study 3-D Structure of Proteins Determining the three-dimensional (3-D) or tertiary structure of a protein is crucial for understanding its function. Two major techniques for this are:
1. X-ray Crystallography This is the most powerful and widely used technique for providing atomic-level resolution of a protein’s 3-D structure.
- Principle: When a beam of high-energy X-rays is passed through a well-ordered, single protein crystal, the electrons in the crystal diffract the X-rays. This produces a characteristic diffraction pattern , consisting of thousands of spots. The position and intensity of these spots depend on the arrangement of atoms within the crystal.
- Procedure:
- Crystallization: First, a highly ordered crystal of the purified protein must be grown. This can be the most difficult and time-consuming part of the process.
- Diffraction Data Collection: The crystal is placed in an X-ray beam and rotated, while a detector records the diffracted X-rays.
- Structure Determination: Using complex mathematical calculations (Fourier transforms), an electron density map is generated from the diffraction pattern. The known amino acid sequence of the protein is then fitted into this electron density map to build an atomic model.
- Limitations: It requires high-quality crystals, which are difficult to obtain for all proteins (especially membrane proteins). It provides a static structure, which may not reflect the protein’s dynamics in solution.
2. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy NMR is another powerful technique that provides information about the structure and dynamics of proteins in solution, which is a more biologically relevant state.
- Principle: The technique is based on the magnetic properties of certain atomic nuclei (like ¹H, ¹³C, ¹⁵N) that possess a property called spin . When a sample of a protein containing these nuclei is placed in a strong magnetic field, the nuclei align in two energy states. When radiofrequency (RF) pulses are applied, the nuclei are excited to the higher energy state. When the pulse is turned off, they relax back to their ground state and emit a signal. The frequency of this signal depends on the nucleus’s local chemical environment (i.e., nearby atoms).
- Procedure:
- Sample Preparation: Requires a pure, concentrated, and soluble protein, often labeled with stable isotopes like ¹³C and ¹⁵N.
- Data Collection: Various types of 2-D and 3-D NMR experiments are performed, which show correlations between different nuclei.
- Structure Determination: Experiments like the Nuclear Overhauser Effect (NOE) provide information about the distances (up to ~5 Å) between nuclei. Using these distance constraints, computational algorithms generate an ensemble of possible models for the protein’s 3-D structure.
- Advantages and Limitations: NMR does not require crystallization and can study the dynamics and interactions of proteins in solution. However, it is generally limited to smaller proteins (typically < 30 kDa) and requires high protein concentrations.
Q6. (a) Write a short note on defects in protein folding. (b) What are biological databases ? Describe secondary protein sequence databases.
Ans. (a) Defects in Protein Folding Protein folding is the process by which a polypeptide chain acquires its biologically active, three-dimensional (3-D) structure. It is a highly precise and essential process. Defects in protein folding occur when a protein fails to fold correctly, causing it either to lose its normal function or to gain a toxic property.
Misfolding and Aggregation: Misfolded proteins are often unstable and have their hydrophobic surfaces exposed. These exposed surfaces cause them to stick to each other and form insoluble aggregates. These aggregates can accumulate inside or outside cells, disrupting cellular function and eventually leading to cell death.
Protein Folding Diseases (Proteinopathies): Many human diseases are associated with protein misfolding and aggregation, known as “proteinopathies” or “amyloidoses”.
- Alzheimer’s Disease: In this neurodegenerative disease, the amyloid-beta (Aβ) peptide and the Tau protein misfold and aggregate to form insoluble plaques and tangles, respectively, in the brain. This leads to neuronal death.
- Parkinson’s Disease: This involves the misfolding and aggregation of the alpha-synuclein (α-synuclein) protein, which forms structures called Lewy bodies within neurons.
- Prion Diseases: These are infectious diseases, such as Creutzfeldt-Jakob disease (CJD). They are caused by the misfolding of the prion protein (PrP) . The misfolded PrP (called PrPSc) can induce normal PrP (PrPC) to misfold in its likeness, starting a chain reaction.
- Cystic Fibrosis: This is a genetic disease in which a mutation in the CFTR protein causes it to misfold and be degraded in the endoplasmic reticulum before it can reach the cell surface. This leads to a defect in chloride ion transport.
Cells have proteins called
chaperones
that assist in correct folding and help to refold or degrade misfolded proteins. However, this protective system can fail with aging or under stress conditions, increasing the risk of disease.
(b) Biological Databases and Secondary Protein Sequence Databases Biological Databases: Biological databases are computer-based collections that store biological data, such as nucleic acid sequences, protein sequences, structures, and functions, in an organized and searchable format. These databases are fundamental tools for research in bioinformatics. They can be broadly classified into:
- Primary Databases: These store raw data (e.g., DNA or protein sequences) derived directly from experimental results. Examples: GenBank (nucleotide sequences) and UniProtKB/Swiss-Prot (protein sequences).
- Secondary Databases: These provide curated and derived information from the analysis of data present in primary databases.
Secondary Protein Sequence Databases: Instead of just storing raw sequences, secondary databases focus on the relationships and patterns among sequences. They organize computationally derived information from primary sequence data. This helps researchers predict the potential function, structure, or family of an unknown protein.
These databases store various types of information, such as:
- Sequence Motifs: Short, conserved sequence patterns that are often associated with a specific function (e.g., a phosphorylation site).
- Structural Domains: Parts of a protein that fold independently and often have a specific function.
- Protein Families: Groups of evolutionarily related proteins.
Examples of Major Secondary Protein Databases:
- PROSITE: This is a collection of biologically significant patterns and profiles to identify protein families and domains. A pattern is a short, qualitatively defined sequence motif, while a profile is a quantitative motif describing the frequency of occurrence of amino acids at each position in a conserved region.
- Pfam (Protein families): This is a large collection of protein domain families. Each family in Pfam is represented by multiple sequence alignments and Hidden Markov Models (HMMs). It is a very sensitive and comprehensive tool for identifying domains in a sequence.
- PRINTS: This is a collection of “fingerprints” for the characterization of protein families. A fingerprint is a group of several conserved motifs that together identify a protein family. This provides higher specificity than a single motif.
- InterPro: This is an integrated database that brings together information from PROSITE, Pfam, PRINTS, and several other secondary databases, providing a comprehensive resource for protein analysis.
Q7. Explain any two of the following : (a) Oxygen binding curves (b) Mechanism of chloride shift (c) Fibrous proteins
Ans. (a) Oxygen Binding Curves An oxygen binding curve is a graph that shows how the saturation of proteins like myoglobin and hemoglobin with oxygen changes with the partial pressure of oxygen (pO₂). This curve reflects the protein’s affinity for oxygen. Myoglobin:
- Myoglobin, found in muscle, has a single polypeptide chain with one heme group.
- Its oxygen binding curve has a hyperbolic shape.
- This indicates that myoglobin binds oxygen tightly even at very low pO₂. It has a very high and constant affinity for oxygen.
- Its P₅₀ (the pO₂ at which the protein is 50% saturated) is very low (around 1 mm Hg).
- This property makes it ideal for oxygen storage in muscles, where it binds oxygen at rest and releases it during exercise when pO₂ drops very low.
Hemoglobin:
- Hemoglobin, found in red blood cells, is a tetramer with four polypeptide chains (typically two alpha and two beta), each with a heme group.
- Its oxygen binding curve has a sigmoidal or ‘S’ shape .
- This ‘S’ shape is a result of cooperative binding . When one oxygen molecule binds to one heme group of hemoglobin, it induces a conformational change in the protein that increases the affinity of the remaining empty heme groups for oxygen. Similarly, the release of one oxygen molecule facilitates the release of the remaining ones.
- This cooperativity allows hemoglobin to efficiently bind oxygen at the high pO₂ in the lungs (around 100 mm Hg) and release it at the low pO₂ in the tissues (around 20-40 mm Hg).
- Its P₅₀ is about 26 mm Hg, making it an effective oxygen transporter .
- Hemoglobin’s affinity is also regulated by allosteric effectors like H⁺, CO₂, and 2,3-bisphosphoglycerate (2,3-BPG) (Bohr effect).
In summary, myoglobin’s hyperbolic curve reflects a storage function, while hemoglobin’s sigmoidal curve reflects its efficient transport function.
(b) Mechanism of Chloride Shift The chloride shift, also known as the Hamburger phenomenon , is a process that occurs in red blood cells (RBCs) and plays a crucial role in the transport of carbon dioxide (CO₂) in the blood. It is the exchange of bicarbonate (HCO₃⁻) and chloride (Cl⁻) ions across the RBC membrane. Steps of the Mechanism:
- CO₂ Production in Tissues: Metabolizing tissues produce CO₂, which diffuses into the blood plasma and then into the red blood cells.
- Formation of Carbonic Acid: Inside the RBC, the enzyme carbonic anhydrase very rapidly converts CO₂ and water (H₂O) into carbonic acid (H₂CO₃). CO₂ + H₂O ⇌ H₂CO₃
- Dissociation into Bicarbonate and Proton: Carbonic acid is an unstable molecule and immediately dissociates into a bicarbonate ion (HCO₃⁻) and a proton (H⁺). H₂CO₃ ⇌ H⁺ + HCO₃⁻
- Exit of Bicarbonate: As the concentration of HCO₃⁻ increases inside the RBC, it moves out of the cell into the plasma. This transport occurs via an antiporter called the Band 3 protein , also known as the chloride-bicarbonate exchanger.
- Entry of Chloride (The Shift): To maintain the electrical neutrality of the RBC, for every HCO₃⁻ ion that moves out, a chloride ion (Cl⁻) moves from the plasma into the RBC. This exchange of ions is the chloride shift .
Significance:
- This mechanism allows CO₂ to be carried in its most soluble form, the bicarbonate ion, in the blood plasma. About 70% of CO₂ is transported this way.
- It also contributes to the blood’s pH buffering system. The H⁺ ions generated inside the RBC bind to hemoglobin, which reduces hemoglobin’s affinity for oxygen (Bohr effect) and promotes the release of oxygen to the tissues.
In the lungs, this process is reversed: Cl⁻ moves out, HCO₃⁻ moves in, is converted back to CO₂, and is then exhaled.
Q8. (a) Discuss the role of calcium and ATP in muscle contraction. (b) Describe the differences between myoglobin and haemoglobin.
Ans. (a) Role of Calcium (Ca²⁺) and ATP in Muscle Contraction Muscle contraction occurs by the sliding filament model , where thick (myosin) filaments slide past thin (actin) filaments, causing the sarcomere to shorten. This process is exquisitely controlled by calcium ions (Ca²⁺) and adenosine triphosphate (ATP).
Role of ATP: ATP is the direct source of energy for muscle contraction and has two crucial functions:
- Providing Energy (for the Power Stroke):
- The myosin head has an ATP-binding site and ATPase (ATP-hydrolyzing enzyme) activity.
- When ATP binds to the myosin head, it causes myosin to detach from actin.
- The ATPase on the myosin head then hydrolyzes ATP to ADP and inorganic phosphate (Pi). The energy released from this hydrolysis “energizes” or “cocks” the myosin head, putting it into a high-energy configuration.
- This energized myosin head can now attach to a binding site on actin, forming a cross-bridge.
- The release of Pi and then ADP causes the myosin head to pivot back to its original, low-energy state. This movement, called the power stroke , pulls the actin filament toward the center of the sarcomere, causing contraction.
- Detaching Myosin from Actin:
- After the power stroke, the myosin head remains tightly bound to actin (the rigor state).
- The binding of a new ATP molecule to the myosin head weakens the bond between actin and myosin, causing the myosin head to detach from actin.
- The cycle of contraction can then begin again. In the absence of ATP, myosin cannot detach from actin, leading to the state of rigidity known as rigor mortis.
Role of Calcium (Ca²⁺): Calcium ions act as a regulatory switch, determining when contraction begins and ends.
- At Rest: When the muscle is relaxed, the concentration of Ca²⁺ in the cytosol is very low because it is actively pumped into the sarcoplasmic reticulum (SR) . In this state, a regulatory protein called tropomyosin covers the myosin-binding sites on the actin filament, preventing cross-bridge formation.
- During Contraction:
- When a nerve impulse (action potential) reaches the muscle cell, it triggers a massive release of Ca²⁺ from the SR into the cytosol.
- The released Ca²⁺ binds to another regulatory protein, troponin (specifically its Troponin C subunit).
- The binding of Ca²⁺ to troponin causes a conformational change in the troponin-tropomyosin complex.
- This structural change pulls tropomyosin away from the myosin-binding sites on the actin filament, exposing these sites.
- The energized myosin heads can now bind to these exposed sites, and the ATP-driven contraction cycle can begin.
- Relaxation: When nerve stimulation ceases, Ca²⁺ is actively pumped back into the SR by ATP-dependent pumps. The drop in cytosolic Ca²⁺ concentration causes Ca²⁺ to dissociate from troponin, tropomyosin moves back to cover the binding sites, and the muscle relaxes.
(b) Differences between Myoglobin and Haemoglobin Myoglobin and hemoglobin are both heme-containing proteins that bind oxygen, but they have significant differences in their structure, function, and location.
| Property | Myoglobin | Haemoglobin |
|---|---|---|
Structure |
Is a monomer ; consists of a single polypeptide chain and one heme group. |
Is a tetramer ; consists of four polypeptide chains (typically 2 alpha, 2 beta) and four heme groups. |
Location |
Found mainly in muscle tissue (especially cardiac and skeletal muscle). |
Found in red blood cells (RBCs) . |
Primary Function |
Oxygen storage in muscles. |
Oxygen transport from the lungs to the tissues. |
Oxygen Affinity |
Has a very high and constant affinity for oxygen. It binds oxygen tightly even at low oxygen pressures. |
Has a variable affinity for oxygen. It shows high affinity in the lungs and low affinity in the tissues. |
Oxygen Binding Curve |
Hyperbolic . |
Sigmoidal or ‘S’-shaped, which reflects cooperative binding. |
Type of Binding |
Non-cooperative; has only one binding site. | Cooperative ; the binding of one oxygen molecule increases the affinity of other sites. |
Allosteric Regulation |
Is not allosterically regulated. |
Is regulated by allosteric effectors like H⁺ (pH), CO₂, and 2,3-BPG (Bohr effect). |
P₅₀ Value |
Very low (around 1 mm Hg), indicating high affinity. | Higher (around 26 mm Hg), indicating lower overall affinity and efficient release. |
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