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IGNOU BBCCT-107 Solved Question Paper PDF
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IGNOU BBCCT-107 Previous Year Solved Question Paper in Hindi
Q1. (क) ‘एंजाइम’ शब्द को परिभाषित कीजिए। एंजाइम की सामान्य विशिष्टताएँ लिखिए। (ख) उदाहरण सहित एंजाइम वर्गीकरण की आई. यू. बी. एम. बी. प्रणाली का वर्णन कीजिए ।
Ans.
(क) एंजाइम की परिभाषा और विशेषताएँ
परिभाषा:
एंजाइम जैविक उत्प्रेरक (बायोकैटेलिस्ट) होते हैं जो जीवित जीवों में जैव रासायनिक अभिक्रियाओं की दर को बढ़ाते हैं, लेकिन स्वयं अभिक्रिया के अंत में अपरिवर्तित रहते हैं। रासायनिक रूप से, अधिकांश एंजाइम प्रोटीन होते हैं, हालांकि कुछ आरएनए अणु (जिन्हें राइबोजाइम कहा जाता है) भी उत्प्रेरक के रूप में कार्य करते हैं।
एंजाइमों की सामान्य विशेषताएँ:
- उत्प्रेरक शक्ति: एंजाइम अभिक्रिया की दर को 10 6 से 10 12 गुना तक बढ़ा सकते हैं। वे अभिक्रिया की सक्रियण ऊर्जा को कम करके ऐसा करते हैं।
- उच्च विशिष्टता: एंजाइम अपनी अभिक्रिया और सब्सट्रेट के प्रति अत्यधिक विशिष्ट होते हैं। एक एंजाइम आमतौर पर केवल एक या कुछ निकट संबंधी सब्सट्रेट पर कार्य करता है। यह विशिष्टता एंजाइम की सक्रिय साइट (एक्टिव साइट) के अद्वितीय त्रि-आयामी आकार के कारण होती है।
- सौम्य परिस्थितियों में कार्य: एंजाइम शारीरिक तापमान (लगभग 37°C), वायुमंडलीय दाब और लगभग तटस्थ pH जैसी हल्की परिस्थितियों में सबसे अच्छा कार्य करते हैं। उच्च तापमान या चरम pH पर वे विकृत (डीनेचर) हो सकते हैं।
- नियमन: एंजाइमों की गतिविधि को विभिन्न तंत्रों, जैसे कि एलोस्टेरिक नियंत्रण, सहसंयोजक संशोधन और संश्लेषण की दर के नियंत्रण के माध्यम से नियंत्रित किया जा सकता है। यह कोशिकाओं को चयापचय मार्गों को आवश्यकतानुसार समायोजित करने की अनुमति देता है।
(ख) IUBMB एंजाइम वर्गीकरण
अंतर्राष्ट्रीय जैव रसायन और आणविक जीवविज्ञान संघ (IUBMB) ने एंजाइमों को उनके द्वारा उत्प्रेरित की जाने वाली अभिक्रिया के प्रकार के आधार पर छह प्रमुख वर्गों में वर्गीकृत किया है। प्रत्येक एंजाइम को एक अद्वितीय चार-अंकीय एंजाइम कमीशन (EC) संख्या दी जाती है।
छह मुख्य वर्ग निम्नलिखित हैं:
- EC 1: ऑक्सीडोरडक्टेसेस (Oxidoreductases): ये एंजाइम ऑक्सीकरण-अपचयन (रेडॉक्स) अभिक्रियाओं को उत्प्रेरित करते हैं, जिसमें एक अणु से दूसरे अणु में इलेक्ट्रॉनों का स्थानांतरण होता है। उदाहरण: लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (EC 1.1.1.27), जो लैक्टेट को पाइरूवेट में ऑक्सीकृत करता है।
- EC 2: ट्रांसफ़ेरेसेस (Transferases): ये एंजाइम एक अणु (दाता) से दूसरे अणु (स्वीकर्ता) में एक कार्यात्मक समूह (जैसे मिथाइल, एसाइल, या फॉस्फेट समूह) के स्थानांतरण को उत्प्रेरित करते हैं। उदाहरण: हेक्सोकाइनेज (EC 2.7.1.1), जो एटीपी से ग्लूकोज में एक फॉस्फेट समूह को स्थानांतरित करता है।
- EC 3: हाइड्रोलेसेस (Hydrolases): ये एंजाइम पानी के अणु को जोड़कर रासायनिक बंधनों को तोड़ते हैं (हाइड्रोलिसिस)। उदाहरण: ट्रिप्सिन (EC 3.4.21.4), जो प्रोटीन में पेप्टाइड बंधनों को तोड़ता है।
- EC 4: लाइसेस (Lyases): ये एंजाइम हाइड्रोलिसिस या ऑक्सीकरण के अलावा अन्य तंत्रों द्वारा रासायनिक बंधनों को तोड़ते हैं, जिससे अक्सर एक दोहरा बंधन बनता है या एक वलय संरचना बनती है। उदाहरण: एल्डोलेज (EC 4.1.2.13), जो फ्रुक्टोज-1,6-बिस्फॉस्फेट को दो तीन-कार्बन शर्करा में तोड़ता है।
- EC 5: आइसोमेरेसेस (Isomerases): ये एंजाइम एक अणु के भीतर परमाणुओं की पुनर्व्यवस्था को उत्प्रेरित करते हैं, जिससे एक आइसोमर बनता है। उदाहरण: फॉस्फोग्लूकोज आइसोमेरेज (EC 5.3.1.9), जो ग्लूकोज-6-फॉस्फेट को फ्रुक्टोज-6-फॉस्फेट में परिवर्तित करता है।
- EC 6: लिगेसेस (Ligases): ये एंजाइम एटीपी जैसे उच्च-ऊर्जा अणु के हाइड्रोलिसिस के साथ-साथ दो अणुओं को जोड़ते हैं। इन्हें सिंथेटेस भी कहा जाता है। उदाहरण: डीएनए लिगेज (EC 6.5.1.1), जो डीएनए के टुकड़ों को जोड़ता है।
Q2. (क) माइकेलिस-मेन्टन समीकरण लिखिए। समीकरण के प्रत्येक पद का अर्थ और महत्व स्पष्ट कीजिए । (ख) क्रमित और क्रमविहीन अनुक्रमिक एन्जाइमेटिक अभिक्रियाओं में अंतर कीजिए ।
Ans.
(क) माइकेलिस-मेन्टन समीकरण
माइकेलिस-मेन्टन समीकरण एक-सब्सट्रेट एंजाइम-उत्प्रेरित अभिक्रियाओं की गतिकी का वर्णन करता है। यह प्रारंभिक अभिक्रिया वेग (V₀) को सब्सट्रेट सांद्रता ([S]) से संबंधित करता है।
समीकरण इस प्रकार है:
V₀ = (Vmax * [S]) / (Km + [S])
समीकरण के पदों का अर्थ और महत्व:
- V₀ (प्रारंभिक वेग): यह अभिक्रिया की प्रारंभिक दर है जब सब्सट्रेट और एंजाइम को मिलाया जाता है और उत्पाद की सांद्रता नगण्य होती है। इसे प्रति इकाई समय में बने उत्पाद की मात्रा के रूप में मापा जाता है।
- Vmax (अधिकतम वेग): यह अधिकतम दर है जिसे एंजाइम-उत्प्रेरित अभिक्रिया प्राप्त कर सकती है। यह तब होता है जब एंजाइम सब्सट्रेट से पूरी तरह संतृप्त हो जाता है (अर्थात, सभी एंजाइम सक्रिय साइटें सब्सट्रेट अणुओं द्वारा भरी होती हैं)। Vmax एंजाइम की सांद्रता के सीधे आनुपातिक होता है।
- [S] (सब्सट्रेट सांद्रता): यह अभिक्रिया मिश्रण में सब्सट्रेट की सांद्रता है।
- Km (माइकेलिस स्थिरांक): Km वह सब्सट्रेट सांद्रता है जिस पर अभिक्रिया का वेग अधिकतम वेग (Vmax) का आधा होता है, अर्थात, V₀ = Vmax/2। Km एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स (ES कॉम्प्लेक्स) के पृथक्करण स्थिरांक का एक माप है और यह एंजाइम के लिए सब्सट्रेट की बंधुता (एफिनिटी) को दर्शाता है। महत्व: एक कम Km मान एक उच्च बंधुता को इंगित करता है, जिसका अर्थ है कि एंजाइम को आधा संतृप्त करने के लिए कम सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है। इसके विपरीत, एक उच्च Km मान एक कम बंधुता को इंगित करता है। यह स्थिरांक एक विशेष एंजाइम-सब्सट्रेट जोड़ी के लिए विशिष्ट होता है।
(ख) क्रमित और क्रमविहीन अनुक्रमिक अभिक्रियाओं में अंतर
अनुक्रमिक अभिक्रियाएँ वे बहु-सब्सट्रेट अभिक्रियाएँ होती हैं जिनमें सभी सब्सट्रेट उत्पाद रिलीज होने से पहले एंजाइम से जुड़ जाते हैं। ये दो प्रकार की होती हैं: क्रमित और क्रमविहीन।
क्रमित अनुक्रमिक अभिक्रिया (Ordered Sequential Reaction) क्रमविहीन अनुक्रमिक अभिक्रिया (Random Sequential Reaction) 1. सब्सट्रेट एक अनिवार्य और विशिष्ट क्रम में एंजाइम से जुड़ते हैं। पहले सब्सट्रेट को ‘अग्रणी सब्सट्रेट’ (leading substrate) कहा जाता है। 1. सब्सट्रेट किसी भी क्रम में एंजाइम से जुड़ सकते हैं। किसी भी सब्सट्रेट के जुड़ने का कोई निश्चित क्रम नहीं है। 2. एक त्रिसदस्यीय कॉम्प्लेक्स (Ternary Complex) बनता है जिसमें एंजाइम और दोनों सब्सट्रेट (E-S1-S2) होते हैं। 2. इसमें भी एक त्रिसदस्यीय कॉम्प्लेक्स (E-S1-S2) बनता है, लेकिन यह दो मार्गों से बन सकता है: E + S1 → ES1 + S2 → ES1S2, या E + S2 → ES2 + S1 → ES1S2। 3. उत्पाद भी एक विशिष्ट क्रम में रिलीज होते हैं। 3. उत्पादों की रिलीज का क्रम भी क्रमविहीन हो सकता है। 4. उदाहरण: कई NAD⁺/NADH-निर्भर डिहाइड्रोजनेज, जैसे लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज । इसमें, सहएंजाइम NAD⁺ हमेशा सब्सट्रेट (लैक्टेट) से पहले जुड़ता है। 4. उदाहरण:
क्रिएटिन काइनेज , जो क्रिएटिन और ATP को क्रिएटिन फॉस्फेट और ADP में परिवर्तित करता है। क्रिएटिन या ATP में से कोई भी पहले एंजाइम से जुड़ सकता है।
संक्षेप में, मुख्य अंतर सब्सट्रेट के जुड़ने के क्रम की बाध्यता है। क्रमित अभिक्रियाओं में एक निश्चित पथ होता है, जबकि क्रमविहीन अभिक्रियाओं में कई पथ संभव होते हैं।
Q3. (क) एंजाइम उत्प्रेरण में सब्सट्रेट/सहकारक की निकटता एवं अभिविन्यास की भूमिका पर चर्चा कीजिए। (ख) दो उदाहरण सहित संक्रामी अवस्था तुल्यरूप पर एक संक्षिप्त टिप्पणी लिखिए।
Ans.
(क) निकटता और अभिविन्यास की भूमिका
एंजाइम उत्प्रेरण में निकटता (proximity) और अभिविन्यास (orientation) प्रभाव दो महत्वपूर्ण कारक हैं जो अभिक्रिया दर को बढ़ाते हैं। ये प्रभाव बताते हैं कि कैसे एक एंजाइम की सक्रिय साइट अभिकारकों को एक साथ लाकर और उन्हें प्रतिक्रिया के लिए सही स्थिति में रखकर उत्प्रेरण को सुगम बनाती है।
- निकटता प्रभाव (Proximity Effect): एक रासायनिक अभिक्रिया होने के लिए, अभिकारक अणुओं को एक-दूसरे से टकराना पड़ता है। विलयन में, ये अणु यादृच्छिक रूप से घूमते हैं, और उनके बीच प्रभावी टकराव की संभावना कम होती है। एंजाइम अपनी सक्रिय साइट में सब्सट्रेट(ओं) और सहकारक(ओं) को बांधकर इस समस्या का समाधान करते हैं।
- यह बंधन अभिकारकों को एक छोटे से स्थान में केंद्रित करता है, जिससे उनकी प्रभावी सांद्रता बहुत बढ़ जाती है।
- उच्च प्रभावी सांद्रता के कारण, अभिकारकों के बीच टकराव की आवृत्ति बढ़ जाती है, जिससे अभिक्रिया की दर में वृद्धि होती है। इसे “उत्प्रेरण द्वारा सामीप्य” (catalysis by approximation) भी कहा जाता है।
- अभिविन्यास प्रभाव (Orientation Effect): केवल टकराव ही पर्याप्त नहीं है; अभिकारकों को अभिक्रिया के लिए सही त्रिविम अभिविन्यास (stereochemical orientation) में टकराना चाहिए। एंजाइम की सक्रिय साइट सब्सट्रेट और सहकारकों को इस तरह से बांधती है कि उनके प्रतिक्रियाशील समूह एक-दूसरे के संबंध में इष्टतम स्थिति और कोण पर होते हैं।
- यह “उत्पादक” टकरावों की संभावना को बढ़ाता है और “अनुत्पादक” टकरावों को कम करता है।
- सक्रिय साइट एक टेम्पलेट के रूप में कार्य करती है जो अभिकारकों को अभिक्रिया की संक्रामी अवस्था (transition state) के लिए सबसे अनुकूल स्थिति में संरेखित करती है। यह अभिक्रिया के लिए आवश्यक सक्रियण ऊर्जा को और कम कर देता है।
संक्षेप में, एंजाइम अभिकारकों को एक साथ ‘पकड़कर’ (निकटता) और उन्हें अभिक्रिया के लिए सही ‘कोण’ पर रखकर (अभिविन्यास) अभिक्रिया दर को नाटकीय रूप से बढ़ाते हैं।
(ख) संक्रामी अवस्था तुल्यरूप (Transition State Analogues)
परिभाषा: संक्रामी अवस्था तुल्यरूप (या एनालॉग) स्थिर अणु होते हैं जिनकी रासायनिक संरचना किसी एंजाइम-उत्प्रेरित अभिक्रिया की संक्रामी अवस्था (transition state) के समान होती है। संक्रामी अवस्था एक उच्च-ऊर्जा, क्षणिक आणविक संरचना है जो सब्सट्रेट से उत्पाद में रूपांतरण के दौरान बनती है।
एंजाइम संक्रामी अवस्था को सब्सट्रेट या उत्पाद की तुलना में बहुत अधिक मजबूती से बांधकर अभिक्रियाओं को उत्प्रेरित करते हैं। इसलिए, संक्रामी अवस्था के ये स्थिर नकलची (तुल्यरूप) एंजाइम के लिए अत्यंत शक्तिशाली और विशिष्ट अवरोधक (inhibitor) के रूप में कार्य करते हैं। वे सब्सट्रेट की तुलना में एंजाइम की सक्रिय साइट से 100 से 10 6 गुना अधिक कसकर बंध सकते हैं।
उदाहरण:
- प्रोलाइन रेसमेस का अवरोध: एंजाइम प्रोलाइन रेसमेस L-प्रोलाइन और D-प्रोलाइन के बीच अंतर-रूपांतरण को उत्प्रेरित करता है। इस अभिक्रिया की संक्रामी अवस्था में प्रोलाइन का α-कार्बन समतलीय (planar) होता है। पाइरोल-2-कार्बोक्सिलेट (Pyrrole-2-carboxylate) एक अणु है जिसकी संरचना स्वाभाविक रूप से समतलीय होती है, जो इस संक्रामी अवस्था की नकल करता है। परिणामस्वरूप, यह प्रोलाइन रेसमेस का एक बहुत शक्तिशाली प्रतिस्पर्धी अवरोधक है, जो सब्सट्रेट (प्रोलाइन) की तुलना में बहुत अधिक मजबूती से बंधता है।
- एडेनोसिन डेमिनेज का अवरोध: यह एंजाइम एडेनोसिन को आयनोसिन में परिवर्तित करने के लिए एक हाइड्रोलिटिक डीएमीनेशन अभिक्रिया को उत्प्रेरित करता है। संक्रामी अवस्था एक टेट्राहेड्रल मध्यवर्ती है। कोफॉर्मिसिन (Coformycin) और पेंटोस्टैटिन जैसे यौगिकों में एक टेट्राहेड्रल कार्बन होता है जो इस संक्रामी अवस्था की नकल करता है। ये यौगिक एडेनोसिन डेमिनेज के अत्यंत शक्तिशाली अवरोधक हैं और इनका उपयोग कुछ प्रकार के ल्यूकेमिया के उपचार में कीमोथेरेपी एजेंट के रूप में किया जाता है।
Q4. (क) ‘आइसोएंजाइम’ शब्द की व्याख्या कीजिए। लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) के आइसोएंजाइम रूपों और उनके नैदानिक महत्व पर चर्चा कीजिए। (ख) संक्षिप्त नाम NAD⁺/NADH का विस्तार कीजिए। दो उपयुक्त उदाहरणों के साथ जैविक रेडॉक्स अभिक्रियाओं में उनकी भूमिका का वर्णन कीजिए।
Ans.
(क) आइसोएंजाइम और LDH
आइसोएंजाइम (या आइसोजाइम): आइसोएंजाइम एक ही जीव में पाए जाने वाले एंजाइम के विभिन्न आणविक रूप होते हैं जो एक ही रासायनिक अभिक्रिया को उत्प्रेरित करते हैं लेकिन उनकी अमीनो एसिड अनुक्रम, भौतिक-रासायनिक गुणों (जैसे इलेक्ट्रोफोरेटिक गतिशीलता, इष्टतम pH) और गतिज मापदंडों (जैसे Km, Vmax) में भिन्नता होती है। ये विभिन्न जीन द्वारा एन्कोड किए जाते हैं या एक ही जीन के विभिन्न उप-इकाइयों (सबयूनिट्स) के संयोजन से बनते हैं। विभिन्न ऊतकों में अक्सर आइसोएंजाइम के अलग-अलग रूप पाए जाते हैं, जो उस ऊतक की चयापचय संबंधी आवश्यकताओं के अनुरूप होते हैं।
लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) के आइसोएंजाइम: लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH) एक क्लासिक उदाहरण है। यह पाइरूवेट और लैक्टेट के बीच प्रतिवर्ती रूपांतरण को उत्प्रेरित करता है। LDH एक टेट्रामर है, जो चार पॉलीपेप्टाइड श्रृंखलाओं से बना है। ये श्रृंखलाएं दो प्रकार की होती हैं: H (हृदय के लिए) और M (मांसपेशी के लिए) , जो विभिन्न जीनों द्वारा एन्कोड की जाती हैं। इन दो सबयूनिट्स (H और M) के विभिन्न संयोजनों से पांच अलग-अलग LDH आइसोएंजाइम बनते हैं:
- LDH-1 (H₄): मुख्य रूप से हृदय की मांसपेशियों और लाल रक्त कोशिकाओं में पाया जाता है।
- LDH-2 (H₃M₁): रेटिकुलोएंडोथेलियल प्रणाली में प्रमुख है।
- LDH-3 (H₂M₂): फेफड़ों और अन्य ऊतकों में पाया जाता है।
- LDH-4 (H₁M₃): गुर्दे और अग्न्याशय में पाया जाता है।
- LDH-5 (M₄): मुख्य रूप से कंकाल की मांसपेशियों और यकृत में पाया जाता है।
नैदानिक महत्व:
क्योंकि LDH आइसोएंजाइम ऊतक-विशिष्ट होते हैं, रक्त सीरम में उनके स्तर का मापन रोग निदान में बहुत उपयोगी है। जब कोई ऊतक क्षतिग्रस्त होता है, तो उसकी कोशिकाएं फट जाती हैं और अपने एंजाइमों को रक्तप्रवाह में छोड़ देती हैं।
- मायोकार्डियल इन्फ्रक्शन (हृदयघात): हृदयघात के बाद, क्षतिग्रस्त हृदय की मांसपेशी से LDH-1 रक्त में रिलीज होता है। यदि रक्त में LDH-1 का स्तर LDH-2 से अधिक हो जाता है (“LDH फ्लिप”), तो यह हृदयघात का एक मजबूत संकेतक है।
- यकृत रोग: हेपेटाइटिस या सिरोसिस जैसे यकृत रोगों में, क्षतिग्रस्त यकृत कोशिकाओं से LDH-5 का स्तर रक्त में बढ़ जाता है।
- अन्य स्थितियां जैसे कि फेफड़ों की बीमारी (LDH-3 में वृद्धि) और मांसपेशियों की चोट (LDH-5 में वृद्धि) का भी पता लगाया जा सकता है।
(ख) NAD⁺/NADH
विस्तार: NAD⁺ का पूरा नाम निकोटिनामाइड एडेनिन डाइन्यूक्लियोटाइड (Nicotinamide Adenine Dinucleotide) है। यह दो रूपों में मौजूद होता है:
- NAD⁺: ऑक्सीकृत रूप (oxidized form)
- NADH: अपचयित रूप (reduced form)
जैविक रेडॉक्स अभिक्रियाओं में भूमिका:
NAD⁺/NADH एक महत्वपूर्ण सहएंजाइम (coenzyme) है जो चयापचय में अनगिनत ऑक्सीकरण-अपचयन (रेडॉक्स) अभिक्रियाओं में एक इलेक्ट्रॉन वाहक के रूप में कार्य करता है। यह डिहाइड्रोजनेज नामक एंजाइमों के लिए एक घुलनशील वाहक के रूप में कार्य करता है।
इसकी मुख्य भूमिका एक सब्सट्रेट से दो इलेक्ट्रॉनों और एक प्रोटॉन (H⁺) को स्वीकार करना और इस प्रकार अपचयित होकर NADH बनना है। यह प्रक्रिया इस प्रकार है:
Substrate-H₂ + NAD⁺ ⇌ Substrate + NADH + H⁺
बना हुआ NADH फिर इन इलेक्ट्रॉनों को इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला (ETC) जैसे अन्य मार्गों में स्थानांतरित कर सकता है, जहाँ एटीपी (ATP) का उत्पादन होता है, या अन्य जैवसंश्लेषण अभिक्रियाओं में अपचायक के रूप में उपयोग किया जा सकता है।
दो उदाहरण:
- ग्लाइकोलाइसिस (Glycolysis): ग्लाइकोलाइसिस के छठे चरण में, एंजाइम ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट डिहाइड्रोजनेज ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट को 1,3-बिस्फॉस्फोग्लिसरेट में ऑक्सीकृत करता है। इस अभिक्रिया में, NAD⁺ एक ऑक्सीकारक एजेंट के रूप में कार्य करता है, जो ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट से इलेक्ट्रॉनों को स्वीकार करके NADH में अपचयित हो जाता है। अभिक्रिया: ग्लिसराल्डिहाइड-3-फॉस्फेट + NAD⁺ + Pᵢ → 1,3-बिस्फॉस्फोग्लिसरेट + NADH + H⁺
- साइट्रिक एसिड चक्र (TCA Cycle): TCA चक्र में कई चरण होते हैं जहाँ NAD⁺ अपचयित होकर NADH बनता है। उदाहरण के लिए, एंजाइम मैलेट डिहाइड्रोजनेज चक्र के अंतिम चरण को उत्प्रेरित करता है, जिसमें मैलेट को ऑक्सालोएसीटेट में ऑक्सीकृत किया जाता है। इस ऑक्सीकरण के दौरान, NAD⁺ इलेक्ट्रॉनों को स्वीकार करता है और NADH में परिवर्तित हो जाता है। अभिक्रिया: मैलेट + NAD⁺ → ऑक्सालोएसीटेट + NADH + H⁺
Q5. (क) एंजाइम निश्चलीभवन के भौतिक अधिशोषण तरीके की व्याख्या कीजिए। (ख) लिपोइक अम्ल के जैविक कार्य तथा कार्यप्रणाली के बारे में वर्णन कीजिए ।
Ans.
(क) एंजाइम निश्चलीभवन: भौतिक अधिशोषण विधि
एंजाइम निश्चलीभवन (Enzyme Immobilization) वह प्रक्रिया है जिसके द्वारा एंजाइम अणुओं को एक अघुलनशील वाहक (carrier) या मैट्रिक्स पर भौतिक रूप से सीमित या स्थानीयकृत किया जाता है। यह एंजाइम की उत्प्रेरक गतिविधि को बनाए रखते हुए उसे घुलनशील अवस्था से विषम अवस्था में परिवर्तित कर देता है। निश्चलित एंजाइमों के कई फायदे हैं, जैसे पुन: उपयोगिता, बढ़ी हुई स्थिरता और उत्पादों का आसान पृथक्करण।
भौतिक अधिशोषण विधि (Physical Adsorption Method): यह निश्चलीभवन की सबसे सरल विधियों में से एक है। इस विधि में, एंजाइम को एक अघुलनशील वाहक पदार्थ की सतह पर संलग्न किया जाता है। यह जुड़ाव कमजोर, गैर-सहसंयोजक बलों के माध्यम से होता है, जैसे:
- वान डर वाल्स बल (Van der Waals forces)
- हाइड्रोजन बंधन (Hydrogen bonds)
- आयनिक अंतःक्रिया (Ionic interactions)
प्रक्रिया: इस प्रक्रिया में आमतौर पर एंजाइम के घोल को वाहक पदार्थ के साथ मिलाया जाता है और उपयुक्त परिस्थितियों (जैसे pH, आयनिक शक्ति, तापमान) में एक निश्चित समय के लिए इनक्यूबेट किया जाता है। एंजाइम वाहक की सतह पर स्वतः ही अधिशोषित हो जाता है। इसके बाद, बिना बंधे हुए एंजाइम को धोकर हटा दिया जाता है।
वाहक पदार्थ: कई प्रकार के अकार्बनिक और कार्बनिक पदार्थों का उपयोग किया जा सकता है, जैसे सक्रिय कार्बन (activated carbon), सिलिका जेल, एल्यूमिना, सेलूलोज, आयन-एक्सचेंज रेजिन और मिट्टी।
लाभ:
- सरल और सस्ती: यह एक आसान और लागत प्रभावी विधि है।
- सौम्य स्थितियाँ: प्रक्रिया हल्की परिस्थितियों में की जाती है, जिससे एंजाइम की संरचना में कोई बड़ा बदलाव नहीं होता और उसकी गतिविधि बनी रहती है।
- कोई रासायनिक संशोधन नहीं: एंजाइम का कोई रासायनिक संशोधन नहीं होता है।
हानियाँ:
- कमजोर बंधन: चूंकि बंधन कमजोर बलों पर आधारित होता है, इसलिए एंजाइम वाहक से “रिसाव” (leakage) कर सकता है, खासकर जब तापमान, pH या सब्सट्रेट सांद्रता में परिवर्तन होता है।
- अविशिष्ट बंधन: अधिशोषण अविशिष्ट हो सकता है, जिससे एंजाइम की सक्रिय साइट अवरुद्ध हो सकती है और गतिविधि कम हो सकती है।
(ख) लिपोइक अम्ल: जैविक कार्य और क्रियाविधि
लिपोइक अम्ल (Lipoic acid), जिसे α-लिपोइक अम्ल या थियोक्टिक अम्ल भी कहा जाता है, एक सल्फर युक्त फैटी एसिड है जो एक महत्वपूर्ण सहएंजाइम (coenzyme) के रूप में कार्य करता है। यह एक प्रोस्थेटिक समूह के रूप में एंजाइमों से सहसंयोजक रूप से जुड़ा होता है।
जैविक कार्य: लिपोइक अम्ल का मुख्य जैविक कार्य एसाइल-समूह स्थानांतरण अभिक्रियाओं में भाग लेना है, विशेष रूप से α-कीटो एसिड के ऑक्सीडेटिव डीकार्बाक्सिलेशन में। यह दो प्रमुख मल्टी-एंजाइम कॉम्प्लेक्स के लिए एक आवश्यक सहकारक है:
- पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज कॉम्प्लेक्स (PDC): यह कॉम्प्लेक्स ग्लाइकोलाइसिस से प्राप्त पाइरूवेट को एसिटाइल-CoA में परिवर्तित करता है, जो साइट्रिक एसिड चक्र (TCA) में प्रवेश करता है।
- α-कीटोग्लूटारेट डिहाइड्रोजनेज कॉम्प्लेक्स (KGDHC): यह कॉम्प्लेक्स TCA चक्र में α-कीटोग्लूटारेट को सक्सिनिल-CoA में परिवर्तित करता है।
इसके अलावा, लिपोइक अम्ल एक शक्तिशाली जैविक एंटीऑक्सीडेंट भी है, जो ऑक्सीकृत (डाइसल्फाइड) और अपचयित (डाइथियोल) दोनों रूपों में कार्य कर सकता है।
क्रियाविधि: लिपोइक अम्ल अपनी संरचना में एक डाइसल्फाइड (-S-S-) बंधन वाली पांच-सदस्यीय रिंग के कारण अद्वितीय है। यह डाइसल्फाइड बंधन आसानी से अपचयित होकर दो थायोल (-SH) समूह बना सकता है, जिससे डाइहाइड्रोलिपोइक अम्ल बनता है।
पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज कॉम्प्लेक्स (PDC) में, लिपोइक अम्ल डाइहाइड्रोलिपोयल ट्रांसएसिटाइलेज (E2) एंजाइम की एक लाइसिन अवशेष से एक एमाइड बंधन के माध्यम से जुड़ा होता है। यह लंबा, लचीला “लिपोइल-लाइसिल आर्म” एक “झूलते हुए हाथ” (swinging arm) की तरह काम करता है:
- सबसे पहले, पाइरूवेट डिहाइड्रोजनेज (E1) पर पाइरूवेट का डीकार्बाक्सिलेशन होता है, और परिणामी हाइड्रॉक्सीएथिल समूह को लिपोइल आर्म के ऑक्सीकृत डाइसल्फाइड बंधन में स्थानांतरित किया जाता है। यह लिपोइल आर्म को अपचयित (डाइथियोल रूप में) और एसिटिलेटेड (एक थायोएस्टर बंधन के माध्यम से) करता है।
- अब, एसिटिलेटेड “स्विंगिंग आर्म” E1 की सक्रिय साइट से E2 की सक्रिय साइट पर जाता है।
- E2 की सक्रिय साइट पर, एसिटाइल समूह को कोएंजाइम A (CoA) में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिससे एसिटाइल-CoA बनता है।
- अपचयित डाइहाइड्रोलिपोइल आर्म अब E2 की सक्रिय साइट से डाइहाइड्रोलिपोयल डिहाइड्रोजनेज (E3) की सक्रिय साइट पर जाता है।
- E3 पर, FAD की मदद से डाइहाइड्रोलिपोइल आर्म को वापस उसके ऑक्सीकृत डाइसल्फाइड रूप में पुन: उत्पन्न किया जाता है, और इलेक्ट्रॉन अंततः NAD⁺ को स्थानांतरित कर दिए जाते हैं, जिससे NADH बनता है।
यह स्विंगिंग आर्म तंत्र मध्यवर्ती को एक सक्रिय साइट से दूसरी सक्रिय साइट पर कुशलतापूर्वक स्थानांतरित करने की अनुमति देता है बिना उन्हें एंजाइम कॉम्प्लेक्स से बाहर जाने दिए।
Q6. (क) कॉलम I में एंजाइम को कॉलम II में संबंधित धातु आयन से मिलाइए : कॉलम I (i) कार्बोक्सीपेप्टीडेज (ii) कैटालेज (iii) साइटोक्रोम ऑक्सीडेज (iv) ग्लूटाथियोन परॉक्सीडेज (v) हैक्सोकाइनेज कॉलम II (l) Fe (2) Cu (3) Mg (4) Zn (5) Se (ख) स्थिर एंजाइम सांद्रता पर, सब्सट्रेट/क्रियाधार की सांद्रता अभिक्रिया की दर को कैसे प्रभावित करती है ? अभिक्रिया की दर को प्रभावित करने वाले अन्य कारकों की व्याख्या कीजिए।
Ans.
(क) कॉलम का मिलान
सही मिलान इस प्रकार है:
कॉलम I (एंजाइम) कॉलम II (धातु आयन) (i) कार्बोक्सीपेप्टीडेज (4) Zn (जिंक) (ii) कैटालेज (1) Fe (आयरन – हीम समूह में) (iii) साइटोक्रोम ऑक्सीडेज (2) Cu (कॉपर – और आयरन भी) (iv) ग्लूटाथियोन परॉक्सीडेज (5) Se (सेलेनियम – सेलेनोसिस्टीन के रूप में) (v) हैक्सोकाइनेज (3) Mg (मैग्नीशियम – ATP-Mg²⁺ कॉम्प्लेक्स के रूप में)
(ख) अभिक्रिया की दर पर विभिन्न कारकों का प्रभाव
एक एंजाइम-उत्प्रेरित अभिक्रिया की दर कई कारकों से प्रभावित होती है।
1. सब्सट्रेट सांद्रता का प्रभाव ([S]):
स्थिर एंजाइम सांद्रता पर, जब सब्सट्रेट सांद्रता ([S]) को बढ़ाया जाता है, तो अभिक्रिया का प्रारंभिक वेग (V₀) भी बढ़ता है।
- कम [S] पर: अभिक्रिया का वेग लगभग सब्सट्रेट सांद्रता के सीधे आनुपातिक होता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि कई एंजाइम सक्रिय साइटें खाली होती हैं, और [S] में वृद्धि से एंजाइम-सब्सट्रेट (ES) कॉम्प्लेक्स बनने की दर बढ़ जाती है।
- उच्च [S] पर: जैसे-जैसे [S] बढ़ता जाता है, एंजाइम की सक्रिय साइटें सब्सट्रेट से संतृप्त होने लगती हैं। एक बिंदु आता है जब लगभग सभी सक्रिय साइटें हर समय भरी रहती हैं। इस बिंदु पर, अभिक्रिया का वेग और नहीं बढ़ता है और एक स्थिर मान तक पहुंच जाता है, जिसे अधिकतम वेग (Vmax) कहा जाता है। इस अवस्था में, दर केवल उस गति से सीमित होती है जिस पर एंजाइम उत्पाद को संसाधित और रिलीज कर सकता है।
यह संबंध एक आयताकार अतिपरवलय (rectangular hyperbola) वक्र द्वारा दर्शाया जाता है, जिसका वर्णन माइकेलिस-मेन्टन समीकरण द्वारा किया गया है।
अभिक्रिया की दर को प्रभावित करने वाले अन्य कारक:
- एंजाइम सांद्रता ([E]): यदि सब्सट्रेट सांद्रता संतृप्त करने वाली (saturating) हो, तो अभिक्रिया की दर (Vmax) सीधे एंजाइम सांद्रता के आनुपातिक होती है। एंजाइम की मात्रा दोगुनी करने से अभिक्रिया की दर भी दोगुनी हो जाएगी क्योंकि उपलब्ध सक्रिय साइटों की संख्या दोगुनी हो जाती है।
- तापमान:
- तापमान बढ़ाने से प्रारंभ में अभिक्रिया की दर बढ़ जाती है क्योंकि अणुओं की गतिज ऊर्जा बढ़ जाती है, जिससे अधिक प्रभावी टकराव होते हैं।
- हालांकि, एक निश्चित इष्टतम तापमान (optimum temperature) के बाद, दर तेजी से घटने लगती है। ऐसा इसलिए है क्योंकि उच्च तापमान एंजाइम की त्रि-आयामी प्रोटीन संरचना को बाधित करता है ( विकृतीकरण या denaturation ), जिससे सक्रिय साइट नष्ट हो जाती है और एंजाइम निष्क्रिय हो जाता है।
- pH: प्रत्येक एंजाइम एक संकीर्ण pH रेंज में अधिकतम गतिविधि दिखाता है, जिसे इष्टतम pH (optimum pH) कहा जाता है। इष्टतम pH से विचलन अभिक्रिया की दर को कम कर देता है। चरम pH मान (बहुत अम्लीय या बहुत क्षारीय) एंजाइम के आयनीकरण की स्थिति को बदल देते हैं, विशेष रूप से सक्रिय साइट में अमीनो एसिड अवशेषों की। इससे सब्सट्रेट बंधन और उत्प्रेरण प्रभावित होता है और अंततः एंजाइम का अपरिवर्तनीय विकृतीकरण हो सकता है। यह संबंध आमतौर पर एक घंटी के आकार का वक्र (bell-shaped curve) बनाता है।
- उत्पाद सांद्रता: उत्पाद के जमा होने से अभिक्रिया की दर धीमी हो सकती है, क्योंकि प्रतिवर्ती अभिक्रिया होने लगती है या उत्पाद एंजाइम की सक्रिय साइट पर बंध कर उसे अवरुद्ध कर सकता है (उत्पाद अवरोध)।
- अवरोधकों और सक्रियकों की उपस्थिति: अवरोधक (Inhibitors) वे अणु होते हैं जो एंजाइम से बंधकर उसकी गतिविधि को कम करते हैं। सक्रियक (Activators) वे अणु होते हैं जो एंजाइम से बंधकर उसकी गतिविधि को बढ़ाते हैं।
Q7. (क) एंजाइम उत्प्रेरित अभिक्रिया के प्रतिस्पर्धी मंदक तथा अप्रतिस्पर्धी मंदक में अंतर कीजिए । (ख) पिंग-पोंग बाई-बाई अभिक्रियाओं का वर्णन कीजिए।
Ans.
(क) प्रतिस्पर्धी और अप्रतिस्पर्धी मंदक में अंतर
एंजाइम मंदक (inhibitor) ऐसे अणु हैं जो एंजाइम से बंधकर उसकी गतिविधि को कम या समाप्त कर देते हैं। प्रतिस्पर्धी और अप्रतिस्पर्धी मंदक दो मुख्य प्रकार के प्रतिवर्ती मंदक हैं।
गुण प्रतिस्पर्धी मंदक (Competitive Inhibition) अप्रतिस्पर्धी मंदक (Uncompetitive Inhibition) संरचना मंदक की संरचना सब्सट्रेट के समान होती है। मंदक की संरचना सब्सट्रेट से भिन्न होती है। बंधन स्थल मंदक एंजाइम की सक्रिय साइट (active site) पर बंधता है और सब्सट्रेट के साथ प्रतिस्पर्धा करता है। मंदक केवल एंजाइम-सब्सट्रेट (ES) कॉम्प्लेक्स से बंधता है, मुक्त एंजाइम से नहीं। यह एक अलग स्थल पर बंधता है। Vmax पर प्रभाव Vmax अपरिवर्तित रहता है। यदि सब्सट्रेट की सांद्रता बहुत अधिक कर दी जाए, तो मंदक का प्रभाव दूर हो जाता है और Vmax प्राप्त किया जा सकता है। Vmax घट जाता है। मंदक ES कॉम्प्लेक्स को एक निष्क्रिय ESI कॉम्प्लेक्स में बदल देता है, जिससे प्रभावी एंजाइम सांद्रता कम हो जाती है। Km पर प्रभाव स्पष्ट (apparent) Km बढ़ जाता है। मंदक की उपस्थिति में, Vmax/2 तक पहुंचने के लिए अधिक सब्सट्रेट की आवश्यकता होती है। स्पष्ट (apparent) Km घट जाता है। मंदक के ES कॉम्प्लेक्स से बंधने से, ले-चेटेलियर के सिद्धांत के अनुसार, ES कॉम्प्लेक्स के निर्माण की दिशा में संतुलन स्थानांतरित हो जाता है, जिससे एंजाइम की सब्सट्रेट के प्रति स्पष्ट बंधुता बढ़ जाती है। लाइनवीवर-बर्क प्लॉट रेखाएँ y-अक्ष पर एक ही बिंदु (1/Vmax) पर प्रतिच्छेद करती हैं, लेकिन x-अक्ष पर अलग-अलग बिंदुओं पर। मंदक की उपस्थिति में प्राप्त रेखा अनियंत्रित अभिक्रिया की रेखा के समानांतर (parallel) होती है। उदाहरण मैलोनेट द्वारा सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज का मंदन। मैलोनेट की संरचना सब्सट्रेट सक्सिनेट के समान होती है। ग्लाइफोसेट (एक हर्बिसाइड) द्वारा EPSP सिंथेज का मंदन। ग्लाइफोसेट एंजाइम-सब्सट्रेट कॉम्प्लेक्स से बंधता है।
(ख) पिंग-पोंग बाई-बाई अभिक्रियाएँ
पिंग-पोंग बाई-बाई अभिक्रिया , जिसे द्वि-विस्थापन अभिक्रिया (Double Displacement Reaction) भी कहा जाता है, एक प्रकार की बहु-सब्सट्रेट एंजाइम अभिक्रिया है। इसकी विशिष्ट विशेषता यह है कि सभी सब्सट्रेट (क्रियाधार) के एंजाइम से जुड़ने से पहले ही एक या एक से अधिक उत्पाद (product) रिलीज हो जाते हैं।
इस क्रियाविधि में, एंजाइम दो स्थिर अवस्थाओं के बीच “पिंग-पोंग” (आगे-पीछे) करता है।
क्रियाविधि का क्रम:
- पहला सब्सट्रेट (A) एंजाइम (E) से जुड़ता है, जिससे EA कॉम्प्लेक्स बनता है।
- एंजाइम A से एक कार्यात्मक समूह को अस्थायी रूप से स्वीकार करता है, जिससे पहला उत्पाद (P) रिलीज होता है। इस प्रक्रिया में, एंजाइम एक संशोधित, स्थिर मध्यवर्ती रूप (F) में परिवर्तित हो जाता है। यह “पिंग” चरण है। E + A → EA → FP → F + P
- अब, संशोधित एंजाइम (F) दूसरे सब्सट्रेट (B) से जुड़ता है, जिससे FB कॉम्प्लेक्स बनता है।
- एंजाइम अपने पर रखे कार्यात्मक समूह को B में स्थानांतरित करता है, जिससे दूसरा उत्पाद (Q) बनता है। इस प्रक्रिया में, एंजाइम अपने मूल रूप (E) में वापस आ जाता है। यह “पोंग” चरण है। F + B → FB → EQ → E + Q
इस क्रियाविधि में कभी भी एक त्रिसदस्यीय कॉम्प्लेक्स (ternary complex) नहीं बनता है जिसमें एंजाइम और दोनों सब्सट्रेट एक साथ जुड़े हों।
गतिज लक्षण (Kinetic Signature): पिंग-पोंग क्रियाविधि का एक विशिष्ट गतिज लक्षण होता है जब इसे लाइनवीवर-बर्क प्लॉट (डबल रेसिप्रोकल प्लॉट) पर दर्शाया जाता है। जब एक सब्सट्रेट की सांद्रता को स्थिर रखते हुए दूसरे की सांद्रता में परिवर्तन किया जाता है, तो प्राप्त रेखाएं समानांतर (parallel) होती हैं। यह अनुक्रमिक क्रियाविधियों से अलग है, जहां रेखाएं एक बिंदु पर प्रतिच्छेद करती हैं।
उदाहरण:
कई ट्रांसएमिनेज (aminotransferases) , जैसे एस्पार्टेट ट्रांसएमिनेज , और कुछ ऑक्सीडेज पिंग-पोंग क्रियाविधि का पालन करते हैं। एस्पार्टेट ट्रांसएमिनेज में, एंजाइम (पाइरिडोक्सल फॉस्फेट युक्त) पहले सब्सट्रेट (जैसे, एस्पार्टेट) से एक एमिनो समूह स्वीकार करता है, जिससे पहला उत्पाद (ऑक्सालोएसीटेट) रिलीज होता है और एंजाइम अपने संशोधित पाइरिडोक्सामिन फॉस्फेट रूप में बदल जाता है। फिर, यह संशोधित एंजाइम दूसरे सब्सट्रेट (α-कीटोग्लूटारेट) को एमिनो समूह दान करता है, जिससे दूसरा उत्पाद (ग्लूटामेट) बनता है और एंजाइम अपने मूल रूप में वापस आ जाता है।
Q8. (क) एंजाइम की निदानीय एंजाइम तथा एंजाइम इलेक्ट्रोड की भूमिका पर चर्चा कीजिए। (ख) फिशर के ताला एवं चाबी की परिकल्पना पर संक्षिप्त टिप्पणी लिखिए एवं उपयुक्त चित्र सहित स्पष्ट कीजिए।
Ans.
(क) निदानीय एंजाइम और एंजाइम इलेक्ट्रोड
1. निदानीय एंजाइम (Enzyme Diagnostics):
नैदानिक एंजाइमोलॉजी चिकित्सा का एक क्षेत्र है जिसमें रोगों के निदान और निगरानी के लिए शरीर के तरल पदार्थों (मुख्य रूप से रक्त सीरम या प्लाज्मा) में एंजाइमों की गतिविधि को मापा जाता है। इसका सिद्धांत यह है कि कई एंजाइम कोशिकाओं के भीतर केंद्रित होते हैं और सामान्य रूप से रक्त में बहुत कम मात्रा में मौजूद होते हैं। जब कोई ऊतक बीमारी या चोट के कारण क्षतिग्रस्त होता है, तो उसकी कोशिकाएं फट जाती हैं और अपने आंतरिक एंजाइमों को रक्तप्रवाह में छोड़ देती हैं, जिससे रक्त में उनकी सांद्रता बढ़ जाती है।
भूमिका और उदाहरण:
- हृदय रोग: मायोकार्डियल इन्फ्रक्शन (हृदयघात) के निदान के लिए क्रिएटिन काइनेज (CK) , विशेष रूप से इसके आइसोएंजाइम CK-MB , और लैक्टेट डिहाइड्रोजनेज (LDH-1) के स्तर को मापा जाता है। इनका बढ़ा हुआ स्तर हृदय की मांसपेशियों की क्षति को इंगित करता है।
- यकृत रोग: हेपेटाइटिस, सिरोसिस या अन्य यकृत क्षति का पता लगाने के लिए एलानिन एमिनोट्रांस्फरेज (ALT) और एस्पार्टेट एमिनोट्रांस्फरेज (AST) के स्तर को मापा जाता है। बढ़ा हुआ ALT यकृत क्षति के लिए काफी विशिष्ट है।
- अग्नाशयशोथ (Pancreatitis): तीव्र अग्नाशयशोथ के निदान के लिए रक्त में एमाइलेज और लाइपेज के स्तर को मापा जाता है।
- हड्डी के रोग और प्रोस्टेट कैंसर: एल्कलाइन फॉस्फेटेज (ALP) का स्तर हड्डी के रोगों में बढ़ सकता है, जबकि एसिड फॉस्फेटेज (ACP) का स्तर प्रोस्टेट कैंसर का एक मार्कर है।
2. एंजाइम इलेक्ट्रोड (Enzyme Electrodes):
एंजाइम इलेक्ट्रोड एक प्रकार का बायोसेंसर है जो एक विशिष्ट पदार्थ की सांद्रता को मापने के लिए एक एंजाइम की उत्प्रेरक गतिविधि का उपयोग करता है। इसमें एक निश्चलित एंजाइम परत (immobilized enzyme layer) होती है जो एक इलेक्ट्रोकेमिकल ट्रांसड्यूसर (जैसे, एक pH इलेक्ट्रोड, ऑक्सीजन इलेक्ट्रोड) की सतह से जुड़ी होती है।
कार्यप्रणाली:
- निश्चलित एंजाइम अपने विशिष्ट सब्सट्रेट (जिसे एनालाइट कहा जाता है) के साथ अभिक्रिया करता है।
- यह अभिक्रिया या तो एक उत्पाद बनाती है या एक अभिकारक का उपभोग करती है जिसे इलेक्ट्रोड द्वारा पता लगाया जा सकता है (जैसे, O₂, H⁺, H₂O₂, NH₃)।
- ट्रांसड्यूसर इस रासायनिक परिवर्तन को एक मापने योग्य विद्युत संकेत (जैसे, करंट या वोल्टेज) में परिवर्तित करता है।
- उत्पन्न विद्युत संकेत एनालाइट की सांद्रता के समानुपाती होता है।
भूमिका और उदाहरण:
इसका सबसे आम उदाहरण ग्लूकोज इलेक्ट्रोड है, जिसका उपयोग मधुमेह रोगियों के रक्त में ग्लूकोज के स्तर को मापने के लिए किया जाता है।
- एंजाइम: ग्लूकोज ऑक्सीडेज (GOx)
- अभिक्रिया: ग्लूकोज + O₂ → ग्लुकोनिक एसिड + H₂O₂
- मापन: इलेक्ट्रोड या तो (a) ऑक्सीजन की खपत को, (b) हाइड्रोजन परॉक्साइड (H₂O₂) के उत्पादन को, या (c) pH में परिवर्तन को माप सकता है। परिणामी संकेत रक्त में ग्लूकोज की सांद्रता को दर्शाता है।
एंजाइम इलेक्ट्रोड अत्यधिक विशिष्ट, संवेदनशील होते हैं और इनका उपयोग यूरिया, लैक्टेट और कोलेस्ट्रॉल जैसे कई अन्य यौगिकों को मापने के लिए भी किया जाता है।
(ख) फिशर की ताला एवं चाबी परिकल्पना (Lock and Key Hypothesis)
ताला एवं चाबी परिकल्पना 1894 में जर्मन रसायनज्ञ एमिल फिशर द्वारा एंजाइम-सब्सट्रेट अंतःक्रिया की विशिष्टता को समझाने के लिए प्रस्तावित की गई थी। यह एंजाइम क्रिया के शुरुआती मॉडलों में से एक है।
परिकल्पना:
इस परिकल्पना के अनुसार, प्रत्येक एंजाइम में एक विशिष्ट, पूर्व-निर्धारित और कठोर त्रि-आयामी संरचना वाली सक्रिय साइट (active site) होती है। इस सक्रिय साइट का आकार अपने विशिष्ट सब्सट्रेट के आकार का सटीक पूरक होता है।
फिशर ने इस अंतःक्रिया की तुलना एक ताले (lock) और उसकी चाबी (key) से की:
- एंजाइम को ताला माना जाता है।
- सब्सट्रेट को चाबी माना जाता है।
जिस तरह केवल एक सही आकार की चाबी ही एक विशिष्ट ताले में फिट हो सकती है और उसे खोल सकती है, उसी तरह केवल एक सही आकार का सब्सट्रेट ही एंजाइम की कठोर सक्रिय साइट में फिट हो सकता है और एक अभिक्रिया को प्रेरित कर सकता है। कोई भी अन्य अणु, जिसका आकार भिन्न हो, सक्रिय साइट में फिट नहीं हो पाएगा, जो एंजाइमों की उच्च सब्सट्रेट विशिष्टता की व्याख्या करता है।
चित्रण:
(एक सरल रेखाचित्र जिसमें एक ‘Y’ आकार के खांचे (सक्रिय साइट) वाला एक एंजाइम (ताला) दिखाया गया है। एक ‘Y’ आकार का सब्सट्रेट (चाबी) इस खांचे में पूरी तरह से फिट होता है, जबकि एक चौकोर या गोल आकार का अणु फिट नहीं हो पाता।)
सीमाएं:
हालांकि यह मॉडल एंजाइम विशिष्टता को सफलतापूर्वक समझाता है, लेकिन यह एक स्थैतिक मॉडल है और इसकी कुछ सीमाएँ हैं:
- यह इस बात की व्याख्या नहीं करता है कि सब्सट्रेट के बंधने के बाद एंजाइम का आकार क्यों बदल सकता है, जैसा कि कई मामलों में देखा गया है।
- यह उत्प्रेरण की गतिशील प्रक्रिया और संक्रामी अवस्था (transition state) के स्थिरीकरण की व्याख्या करने में विफल रहता है।
इन सीमाओं को दूर करने के लिए, बाद में प्रेरित-फिट मॉडल (Induced-Fit Model) को डेनियल कोशलैंड द्वारा प्रस्तावित किया गया, जो बताता है कि सब्सट्रेट के बंधन से एंजाइम की सक्रिय साइट में संरचनात्मक परिवर्तन होते हैं, जो उत्प्रेरण के लिए आवश्यक हैं।
Q9. (क) उपयुक्त चित्र सहित लाइसोजाइम की क्रियाविधि की व्याख्या कीजिए। (ख) एंजाइमों का खण्डीभवन कैसे उपापचयी पथों का नियंत्रण करने में मदद करता है ? दो एंजाइमों के नाम बताइये जिनका उपयोग माइटोकॉन्ड्िया के लिये मार्कर के रूप में किया जाता है।
Ans.
(क) लाइसोजाइम की क्रियाविधि
लाइसोजाइम एक एंजाइम है जो कई जीवों (जैसे आंसू, लार, अंडे की सफेदी) में पाया जाता है और जीवाणु कोशिका भित्ति के एक प्रमुख घटक, पेप्टिडोग्लाइकन को तोड़कर जीवाणुरोधी एजेंट के रूप में कार्य करता है। यह पेप्टिडोग्लाइकन में N-एसिटाइलम्यूरेमिक एसिड (NAM) और N-एसिटाइलग्लूकोसामाइन (NAG) के बीच β(1→4) ग्लाइकोसिडिक बंधन के हाइड्रोलिसिस को उत्प्रेरित करता है।
क्रियाविधि (फिलिप्स क्रियाविधि):
लाइसोजाइम की क्रियाविधि को उसकी त्रि-आयामी संरचना के आधार पर समझाया गया था। एंजाइम में एक लंबी दरार (cleft) होती है जो सक्रिय साइट के रूप में कार्य करती है और पेप्टिडोग्लाइकन श्रृंखला के छह शर्करा अवशेषों (A-F नाम दिया गया) को बांध सकती है। बंधन टूटना शर्करा D (NAM) और E (NAG) के बीच होता है।
दो प्रमुख अमीनो एसिड अवशेष उत्प्रेरण में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं:
- ग्लूटामेट 35 (Glu-35): यह एक गैर-ध्रुवीय (non-polar) वातावरण में स्थित है, इसलिए यह प्रोटोनेटेड (COOH के रूप में) रहता है।
- एस्पार्टेट 52 (Asp-52): यह एक ध्रुवीय (polar) वातावरण में स्थित है, इसलिए यह डीप्रोटोनेटेड (COO⁻ के रूप में) रहता है।
चरण-दर-चरण प्रक्रिया:
- सामान्य अम्ल उत्प्रेरण: Glu-35 एक सामान्य अम्ल के रूप में कार्य करता है। यह अपने प्रोटॉन को शर्करा D और E के बीच ग्लाइकोसिडिक ऑक्सीजन को दान करता है, जिससे C-O बंधन टूट जाता है और शर्करा E रिलीज हो जाती है।
- ऑक्सोकार्बेनियम आयन का स्थिरीकरण: शर्करा D पर एक क्षणिक, धनात्मक रूप से आवेशित ऑक्सोकार्बेनियम आयन मध्यवर्ती (oxocarbenium ion intermediate) बनता है। यह मध्यवर्ती बहुत अस्थिर होता है, लेकिन Asp-52 का ऋणात्मक आवेश इसे इलेक्ट्रोस्टैटिक रूप से स्थिर करता है।
- जल अणु का आक्रमण: एक जल का अणु (H₂O) सक्रिय साइट में प्रवेश करता है और ऑक्सोकार्बेनियम आयन पर न्यूक्लियोफिलिक रूप से आक्रमण करता है।
- सामान्य क्षार उत्प्रेरण: अब डीप्रोटोनेटेड Glu-35 (जो अब COO⁻ के रूप में है) एक सामान्य क्षार के रूप में कार्य करता है। यह जल के अणु से एक प्रोटॉन को स्वीकार करता है, जिससे एक हाइड्रॉक्सिल समूह (OH) का निर्माण होता है जो शर्करा D से जुड़ जाता है।
इस प्रक्रिया के अंत में, ग्लाइकोसिडिक बंधन टूट जाता है, शर्करा D रिलीज हो जाती है, और एंजाइम (Glu-35 और Asp-52) अपने मूल स्थिति में वापस आ जाते हैं, अगले उत्प्रेरक चक्र के लिए तैयार।
(ख) उपापचयी पथों में खण्डीभवन और माइटोकॉन्ड्रियल मार्कर
उपापचयी पथों के नियंत्रण में खण्डीभवन (Compartmentation):
खण्डीभवन का अर्थ है यूकैरियोटिक कोशिकाओं के भीतर विशिष्ट उपापचयी पथों और एंजाइमों का विभिन्न कोशिकांगों (organelles) जैसे माइटोकॉन्ड्रिया, साइटोसोल, लाइसोसोम, और एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम में स्थानीयकरण। यह चयापचय के कुशल नियंत्रण और नियमन के लिए एक मौलिक रणनीति है।
खण्डीभवन निम्नलिखित तरीकों से मदद करता है:
- विरोधी पथों का पृथक्करण: यह परस्पर विरोधी उपापचयी पथों को एक-दूसरे से अलग रखता है। उदाहरण के लिए, फैटी एसिड का संश्लेषण (fatty acid synthesis) साइटोसोल में होता है, जबकि फैटी एसिड का ऑक्सीकरण (β-oxidation) माइटोकॉन्ड्रिया में होता है। यह पृथक्करण एक व्यर्थ चक्र (futile cycle) को रोकता है जहाँ एक अणु का संश्लेषण और क्षरण एक साथ होता है।
- स्थानीय सांद्रता में वृद्धि: यह एक विशिष्ट पथ के लिए आवश्यक सब्सट्रेट, मध्यवर्ती और सहकारकों की स्थानीय सांद्रता को बढ़ाता है। इससे एंजाइमों के लिए सब्सट्रेट की उपलब्धता बढ़ती है और अभिक्रिया की समग्र दक्षता में सुधार होता है।
- विशिष्ट वातावरण का निर्माण: प्रत्येक कोशिकांग एक अद्वितीय जैव रासायनिक वातावरण (जैसे pH, रेडॉक्स स्थिति) प्रदान कर सकता है जो वहां होने वाली अभिक्रियाओं के लिए अनुकूलित होता है। उदाहरण के लिए, लाइसोसोम का अम्लीय वातावरण (pH ~5) हाइड्रोलाइटिक एंजाइमों के लिए इष्टतम है।
- कुशल नियमन: कोशिकांगों के बीच मेटाबोलाइट्स के परिवहन को नियंत्रित करके, कोशिका पूरे उपापचयी प्रवाह को नियंत्रित कर सकती है। झिल्ली परिवहन प्रोटीन चयापचय के महत्वपूर्ण नियंत्रण बिंदु के रूप में कार्य करते हैं।
माइटोकॉन्ड्रिया के मार्कर एंजाइम:
मार्कर एंजाइम वे एंजाइम होते हैं जो मुख्य रूप से एक विशेष कोशिकांग के लिए विशिष्ट होते हैं। सेल फ्रैक्शननेशन के दौरान विभिन्न अंशों की शुद्धता का आकलन करने के लिए उनका उपयोग किया जाता है।
माइटोकॉन्ड्रिया के लिए दो प्रमुख मार्कर एंजाइम हैं:
- सक्सिनेट डिहाइड्रोजनेज (Succinate Dehydrogenase): यह एंजाइम माइटोकॉन्ड्रिया की आंतरिक झिल्ली (inner mitochondrial membrane) में मजबूती से बंधा होता है। यह साइट्रिक एसिड चक्र और इलेक्ट्रॉन परिवहन श्रृंखला दोनों का हिस्सा है।
- साइट्रेट सिंथेज (Citrate Synthase): यह एंजाइम माइटोकॉन्ड्रियल मैट्रिक्स (matrix) में स्थित है और साइट्रिक एसिड चक्र के पहले चरण को उत्प्रेरित करता है।
इन एंजाइमों की उपस्थिति का पता लगाना एक कोशिका अंश में माइटोकॉन्ड्रिया की उपस्थिति की पुष्टि करता है।
IGNOU BBCCT-107 Previous Year Solved Question Paper in English
Q1. (a) Define the term ‘enzyme’. Write general characteristics of an enzyme. (b) Describe IUBMB classification of enzymes with examples.
Ans. (a) Definition and Characteristics of an Enzyme Definition: Enzymes are biological catalysts (biocatalysts) that increase the rate of biochemical reactions within living organisms without being consumed or altered in the process. Chemically, most enzymes are proteins, although some RNA molecules, known as ribozymes, also function as catalysts. General Characteristics of Enzymes:
- Catalytic Power: Enzymes can increase reaction rates by a factor of 10 6 to 10 12 . They achieve this by lowering the activation energy of the reaction.
- High Specificity: Enzymes are highly specific for their substrates and the reactions they catalyze. An enzyme typically acts on only one or a few closely related substrates. This specificity is due to the unique three-dimensional shape of the enzyme’s active site.
- Action under Mild Conditions: Enzymes function optimally under mild physiological conditions, such as body temperature (around 37°C), atmospheric pressure, and near-neutral pH. They can be denatured by high temperatures or extreme pH.
- Regulation: The activity of enzymes can be regulated through various mechanisms, such as allosteric control, covalent modification, and control of their rate of synthesis. This allows cells to adjust metabolic pathways as needed.
(b) IUBMB Classification of Enzymes
The International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) has classified enzymes into six major classes based on the type of reaction they catalyze. Each enzyme is assigned a unique four-digit Enzyme Commission (EC) number.
The six main classes are:
- EC 1: Oxidoreductases: These enzymes catalyze oxidation-reduction (redox) reactions, involving the transfer of electrons from one molecule to another. Example: Lactate dehydrogenase (EC 1.1.1.27), which oxidizes lactate to pyruvate.
- EC 2: Transferases: These enzymes catalyze the transfer of a functional group (e.g., a methyl, acyl, or phosphate group) from one molecule (the donor) to another (the acceptor). Example: Hexokinase (EC 2.7.1.1), which transfers a phosphate group from ATP to glucose.
- EC 3: Hydrolases: These enzymes catalyze the cleavage of chemical bonds by the addition of a water molecule (hydrolysis). Example: Trypsin (EC 3.4.21.4), which hydrolyzes peptide bonds in proteins.
- EC 4: Lyases: These enzymes cleave chemical bonds by mechanisms other than hydrolysis or oxidation, often forming a double bond or a ring structure in the process. Example: Aldolase (EC 4.1.2.13), which cleaves fructose-1,6-bisphosphate into two three-carbon sugars.
- EC 5: Isomerases: These enzymes catalyze the rearrangement of atoms within a single molecule, thereby converting one isomer to another. Example: Phosphoglucose isomerase (EC 5.3.1.9), which converts glucose-6-phosphate to fructose-6-phosphate.
- EC 6: Ligases: These enzymes join two molecules together, coupled with the hydrolysis of a high-energy molecule like ATP. They are also called synthetases. Example: DNA ligase (EC 6.5.1.1), which joins fragments of DNA.
Q2. (a) Write Michaelis-Menten equation. Explain the meaning and significance of each term in the equation. (b) Differentiate between ordered and random sequential enzymatic reactions.
Ans. (a) Michaelis-Menten Equation The Michaelis-Menten equation describes the kinetics of many single-substrate enzyme-catalyzed reactions. It relates the initial reaction velocity (V₀) to the substrate concentration ([S]). The equation is as follows: V₀ = (Vmax * [S]) / (Km + [S]) Meaning and Significance of Each Term:
- V₀ (Initial Velocity): This is the initial rate of the reaction when the substrate and enzyme are mixed and the concentration of product is negligible. It is measured as the amount of product formed per unit time.
- Vmax (Maximum Velocity): This is the maximum rate that the enzyme-catalyzed reaction can achieve. It occurs when the enzyme is fully saturated with the substrate (i.e., all enzyme active sites are occupied by substrate molecules). Vmax is directly proportional to the enzyme concentration.
- [S] (Substrate Concentration): This is the concentration of the substrate in the reaction mixture.
- Km (Michaelis Constant): Km is the substrate concentration at which the reaction velocity is half of the maximum velocity (Vmax), i.e., when V₀ = Vmax/2. Km is a measure of the dissociation constant of the enzyme-substrate complex (ES complex) and reflects the affinity of the enzyme for its substrate. Significance: A low Km value indicates a high affinity, meaning less substrate is needed to half-saturate the enzyme. Conversely, a high Km value indicates a low affinity. This constant is characteristic of a particular enzyme-substrate pair.
(b) Difference Between Ordered and Random Sequential Reactions
Sequential reactions are multi-substrate reactions in which all substrates must bind to the enzyme before any product is released. They can be of two types: ordered and random.
Ordered Sequential Reaction |
Random Sequential Reaction |
|
1. Substrates bind to the enzyme in a compulsory and specific order . The first substrate to bind is called the ‘leading substrate’. |
1. Substrates can bind to the enzyme in any order . There is no preferred order of binding. |
| 2. A ternary complex is formed, containing the enzyme and both substrates (E-S1-S2). | 2. A ternary complex (E-S1-S2) is also formed, but it can be formed via two pathways: E + S1 → ES1 + S2 → ES1S2, or E + S2 → ES2 + S1 → ES1S2. |
| 3. Products are also released in a specific, defined order. | 3. The release of products can also be random. |
|
4. Example: Many NAD⁺/NADH-dependent dehydrogenases, such as Lactate Dehydrogenase . In this case, the coenzyme NAD⁺ always binds before the substrate (lactate). |
4. Example: Creatine Kinase , which converts creatine and ATP to creatine phosphate and ADP. Either creatine or ATP can bind to the enzyme first. |
In summary, the key difference is the
constraint on the order of substrate binding
. Ordered reactions have a single, defined pathway, whereas random reactions have multiple possible pathways.
Q3. (a) Discuss the role of orientation and proximity of substrate/cofactor in enzyme catalysis. (b) Write a short note on transition state analogues, citing two examples.
Ans. (a) Role of Proximity and Orientation The proximity and orientation effects are two key factors in enzyme catalysis that contribute to the massive rate enhancement. These effects describe how an enzyme’s active site facilitates catalysis by bringing reactants together and positioning them correctly for reaction.
- Proximity Effect: For a chemical reaction to occur, the reactant molecules must collide with one another. In solution, these molecules move randomly, and the probability of their effective collision is low. Enzymes solve this problem by binding the substrate(s) and cofactor(s) in their active site.
- This binding concentrates the reactants in a small volume, thereby greatly increasing their effective concentration .
- Due to the high effective concentration, the frequency of collisions between reactants increases, leading to an increase in the reaction rate. This is also known as “catalysis by approximation.”
- Orientation Effect: Mere collision is not enough; the reactants must collide in the correct stereochemical orientation for a reaction to occur. The active site of an enzyme binds substrates and cofactors in such a way that their reactive groups are in the optimal position and angle relative to each other.
- This increases the probability of “productive” collisions and reduces “unproductive” ones.
- The active site acts as a template that aligns the reactants in the most favorable geometry for the reaction’s transition state. This further reduces the activation energy required for the reaction.
In essence, enzymes dramatically accelerate reaction rates by ‘holding’ reactants together (proximity) and at the correct ‘angle’ for reaction (orientation).
(b) Transition State Analogues
Definition:
Transition state analogues are stable molecules that are chemically and structurally similar to the
transition state
of an enzyme-catalyzed reaction. The transition state is a high-energy, transient molecular structure that is formed during the conversion of a substrate to a product.
Enzymes catalyze reactions by binding to the transition state much more tightly than they bind to the substrate or product. Therefore, these stable mimics (analogues) of the transition state act as extremely potent and specific inhibitors of the enzyme. They can bind to the enzyme’s active site 100 to 10
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times more tightly than the substrate itself.
Examples:
- Inhibition of Proline Racemase: The enzyme proline racemase catalyzes the interconversion between L-proline and D-proline. The transition state of this reaction involves a planar α-carbon of proline. Pyrrole-2-carboxylate is a molecule that is naturally planar, thus mimicking this transition state. As a result, it is a very powerful competitive inhibitor of proline racemase, binding much more tightly than the substrate (proline).
- Inhibition of Adenosine Deaminase: This enzyme catalyzes a hydrolytic deamination reaction to convert adenosine to inosine. The transition state is a tetrahedral intermediate . Compounds like Coformycin and Pentostatin have a tetrahedral carbon that mimics this transition state. These compounds are extremely potent inhibitors of adenosine deaminase and are used as chemotherapy agents in the treatment of some types of leukemia.
Q4. (a) Explain the term ‘isoenzymes’. Discuss the isoenzyme forms of Lactate Dehydrogenase (LDH) and their clinical significance. (b) Expand the acronym NAD⁺/NADH. Illustrate their role in biological redox reactions with two suitable examples.
Ans. (a) Isoenzymes and LDH Isoenzymes (or Isozymes): Isoenzymes are different molecular forms of an enzyme found within the same organism that catalyze the same chemical reaction but differ in their amino acid sequence, physicochemical properties (like electrophoretic mobility, optimal pH), and kinetic parameters (like Km, Vmax). They are encoded by different genes or arise from the combination of different subunits from the same gene. Different tissues often have different isoenzyme forms, which are suited to the metabolic needs of that tissue. Isoenzyme forms of Lactate Dehydrogenase (LDH): Lactate dehydrogenase (LDH) is a classic example. It catalyzes the reversible conversion between pyruvate and lactate. LDH is a tetramer , composed of four polypeptide chains. These chains are of two types: H (for Heart) and M (for Muscle) , which are encoded by different genes. The various combinations of these two subunits (H and M) result in five distinct LDH isoenzymes:
- LDH-1 (H₄): Found predominantly in heart muscle and red blood cells.
- LDH-2 (H₃M₁): Predominant in the reticuloendothelial system.
- LDH-3 (H₂M₂): Found in the lungs and other tissues.
- LDH-4 (H₁M₃): Found in the kidney and pancreas.
- LDH-5 (M₄): Found predominantly in skeletal muscle and the liver.
Clinical Significance:
Because LDH isoenzymes are tissue-specific, the measurement of their levels in blood serum is very useful in disease diagnosis. When a tissue is damaged, its cells lyse and release their enzymes into the bloodstream.
- Myocardial Infarction (Heart Attack): Following a heart attack, LDH-1 is released from the damaged heart muscle into the blood. A strong indicator of a heart attack is when the level of LDH-1 in the blood becomes higher than that of LDH-2 (an “LDH flip”).
- Liver Disease: In liver diseases such as hepatitis or cirrhosis, the level of LDH-5 is elevated in the blood due to release from damaged liver cells.
- Other conditions such as lung disease (increase in LDH-3) and muscle injury (increase in LDH-5) can also be detected.
(b) NAD⁺/NADH
Expansion:
The full name for NAD⁺ is
Nicotinamide Adenine Dinucleotide
. It exists in two forms:
- NAD⁺: The oxidized form
- NADH: The reduced form
Role in Biological Redox Reactions:
NAD⁺/NADH is a crucial
coenzyme
that functions as an electron carrier in countless oxidation-reduction (redox) reactions in metabolism. It acts as a soluble carrier for enzymes called dehydrogenases.
Its primary role is to accept two electrons and one proton (H⁺) from a substrate, thereby becoming reduced to NADH. The process is:
Substrate-H₂ + NAD⁺ ⇌ Substrate + NADH + H⁺
The resulting NADH can then transfer these electrons to other pathways, such as the electron transport chain (ETC) for ATP production, or be used as a reducing agent in other biosynthetic reactions.
Two Examples:
- Glycolysis: In the sixth step of glycolysis, the enzyme Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase oxidizes glyceraldehyde-3-phosphate to 1,3-bisphosphoglycerate. In this reaction, NAD⁺ acts as the oxidizing agent, accepting electrons from glyceraldehyde-3-phosphate to become reduced to NADH. Reaction: Glyceraldehyde-3-phosphate + NAD⁺ + Pᵢ → 1,3-Bisphosphoglycerate + NADH + H⁺
- Citric Acid Cycle (TCA Cycle): The TCA cycle has several steps where NAD⁺ is reduced to NADH. For example, the enzyme Malate dehydrogenase catalyzes the final step of the cycle, in which malate is oxidized to oxaloacetate. During this oxidation, NAD⁺ accepts the electrons and is converted to NADH. Reaction: Malate + NAD⁺ → Oxaloacetate + NADH + H⁺
Q5. (a) Explain physical adsorption method of enzyme immobilization. (b) Describe biological function and mechanism of action of lipoic acid.
Ans. (a) Enzyme Immobilization: Physical Adsorption Method Enzyme immobilization is the process by which enzyme molecules are physically confined or localized onto an insoluble carrier or matrix. This converts the enzyme from a soluble to a heterogeneous state while retaining its catalytic activity. Immobilized enzymes have several advantages, such as reusability, enhanced stability, and easier separation of products. Physical Adsorption Method: This is one of the simplest methods of immobilization. In this method, the enzyme is attached to the surface of an insoluble carrier. This attachment occurs via weak, non-covalent forces , such as:
- Van der Waals forces
- Hydrogen bonds
- Ionic interactions
Procedure:
The process typically involves mixing a solution of the enzyme with the carrier material and incubating for a period under suitable conditions (e.g., pH, ionic strength, temperature). The enzyme spontaneously adsorbs onto the surface of the carrier. Afterwards, the unbound enzyme is washed away.
Carrier Materials:
A wide range of inorganic and organic materials can be used, such as activated carbon, silica gel, alumina, cellulose, ion-exchange resins, and clays.
Advantages:
- Simple and Cheap: It is an easy and cost-effective method.
- Mild Conditions: The process is carried out under mild conditions, causing no major change in the enzyme’s conformation and preserving its activity.
- No Chemical Modification: There is no chemical modification of the enzyme.
Disadvantages:
- Weak Binding: Since the binding is based on weak forces, the enzyme can “leak” from the carrier, especially with changes in temperature, pH, or substrate concentration.
- Nonspecific Binding: Adsorption can be nonspecific, potentially blocking the enzyme’s active site and reducing activity.
(b) Lipoic Acid: Biological Function and Mechanism of Action
Lipoic acid
, also known as α-lipoic acid or thioctic acid, is a sulfur-containing fatty acid that serves as a vital
coenzyme
. It is covalently attached to enzymes as a prosthetic group.
Biological Function:
The primary biological function of lipoic acid is to participate in
acyl-group transfer reactions
, particularly in the oxidative decarboxylation of α-keto acids. It is an essential cofactor for two major multi-enzyme complexes:
- Pyruvate Dehydrogenase Complex (PDC): This complex converts pyruvate from glycolysis into acetyl-CoA, which enters the citric acid (TCA) cycle.
- α-Ketoglutarate Dehydrogenase Complex (KGDHC): This complex converts α-ketoglutarate to succinyl-CoA in the TCA cycle.
Additionally, lipoic acid is also a powerful biological antioxidant, capable of functioning in both its oxidized (disulfide) and reduced (dithiol) forms.
Mechanism of Action:
Lipoic acid is unique due to its five-membered ring containing a disulfide (-S-S-) bond. This disulfide bond can be readily reduced to form two thiol (-SH) groups, yielding dihydrolipoic acid.
In the Pyruvate Dehydrogenase Complex (PDC), lipoic acid is attached via an amide bond to a lysine residue of the enzyme dihydrolipoyl transacetylase (E2). This long, flexible “lipoyl-lysyl arm” acts like a
“swinging arm”
:
- First, pyruvate is decarboxylated on Pyruvate Dehydrogenase (E1), and the resulting hydroxyethyl group is transferred to the oxidized disulfide bond of the lipoyl arm. This reduces and acetylates the lipoyl arm (via a thioester bond).
- The acetylated “swinging arm” now moves from the active site of E1 to the active site of E2.
- At the active site of E2, the acetyl group is transferred to Coenzyme A (CoA), forming acetyl-CoA .
- The reduced dihydrolipoyl arm now swings from the active site of E2 to the active site of dihydrolipoyl dehydrogenase (E3).
- At E3, the dihydrolipoyl arm is re-oxidized back to its disulfide form with the help of FAD, and the electrons are ultimately transferred to NAD⁺, forming NADH.
This swinging arm mechanism allows for the efficient transfer of intermediates from one active site to another without them diffusing away from the enzyme complex.
Q6. (a) Match the enzyme in Column I with associated metal ion in Column II: Column I (i) Carboxypeptidase (ii) Catalase (iii) Cytochrome oxidase (iv) Glutathione peroxidase (v) Hexokinase Column II (l) Fe (2) Cu (3) Mg (4) Zn (5) Se (b) At constant enzyme concentration, how does concentration of substrate affect the rate of a reaction ? Explain other factors that affect the rate of a reaction.
Ans. (a) Matching Columns The correct matches are as follows:
Column I (Enzyme) |
Column II (Metal Ion) |
| (i) Carboxypeptidase | (4) Zn (Zinc) |
| (ii) Catalase | (1) Fe (Iron – in a heme group) |
| (iii) Cytochrome oxidase | (2) Cu (Copper – and also Iron) |
| (iv) Glutathione peroxidase | (5) Se (Selenium – as selenocysteine) |
| (v) Hexokinase | (3) Mg (Magnesium – as an ATP-Mg²⁺ complex) |
(b) Factors Affecting Reaction Rate
The rate of an enzyme-catalyzed reaction is influenced by several factors.
1. Effect of Substrate Concentration ([S]):
At a constant enzyme concentration, as the substrate concentration ([S]) is increased, the initial velocity (V₀) of the reaction also increases.
- At low [S]: The reaction velocity is almost directly proportional to the substrate concentration. This is because many enzyme active sites are empty, and an increase in [S] increases the rate of enzyme-substrate (ES) complex formation.
- At high [S]: As [S] increases further, the active sites of the enzyme begin to become saturated with substrate. A point is reached where nearly all active sites are occupied at all times. At this point, the reaction velocity no longer increases and approaches a constant value, known as the maximum velocity (Vmax) . In this state, the rate is limited only by the speed at which the enzyme can process and release the product.
This relationship is represented by a
rectangular hyperbola
curve, described by the Michaelis-Menten equation.
Other Factors Affecting Reaction Rate:
- Enzyme Concentration ([E]): If the substrate concentration is saturating, the reaction rate (Vmax) is directly proportional to the enzyme concentration. Doubling the amount of enzyme will double the reaction rate because the number of available active sites is doubled.
- Temperature:
- Increasing the temperature initially increases the reaction rate because molecules have more kinetic energy, leading to more frequent and effective collisions.
- However, beyond a certain optimum temperature , the rate begins to decrease rapidly. This is because high temperatures disrupt the enzyme’s three-dimensional protein structure ( denaturation ), destroying the active site and inactivating the enzyme.
- pH: Each enzyme exhibits maximum activity over a narrow pH range, known as the optimum pH . Deviation from the optimum pH reduces the reaction rate. Extreme pH values (very acidic or very basic) alter the ionization state of the enzyme, particularly the amino acid residues in the active site. This affects substrate binding and catalysis and can eventually lead to irreversible denaturation of the enzyme. This relationship typically forms a bell-shaped curve .
- Product Concentration: The accumulation of product can slow down the reaction rate, either because the reverse reaction starts to occur or because the product can bind to the active site and block it (product inhibition).
- Presence of Inhibitors and Activators: Inhibitors are molecules that bind to the enzyme and decrease its activity. Activators are molecules that bind to the enzyme and increase its activity.
Q7. (a) Differentiate between competitive and uncompetitive inhibition of an enzyme catalyzed reaction. (b) Describe ping-pong bi-bi reactions.
Ans. (a) Difference Between Competitive and Uncompetitive Inhibition Enzyme inhibitors are molecules that bind to enzymes and decrease or abolish their activity. Competitive and uncompetitive inhibition are two major types of reversible inhibition.
Property |
Competitive Inhibition |
Uncompetitive Inhibition |
Structure |
Inhibitor structure resembles the substrate. | Inhibitor structure is different from the substrate. |
Binding Site |
The inhibitor binds to the active site of the enzyme and competes with the substrate. |
The inhibitor binds only to the enzyme-substrate (ES) complex , not to the free enzyme. It binds at a separate site. |
Effect on Vmax |
Vmax remains unchanged. The effect of the inhibitor can be overcome by a very high substrate concentration, and Vmax can still be reached. |
Vmax is decreased. The inhibitor converts the ES complex into an inactive ESI complex, thus reducing the effective enzyme concentration. |
Effect on Km |
Apparent Km is increased. In the presence of the inhibitor, more substrate is required to reach Vmax/2. |
Apparent Km is decreased. The binding of the inhibitor to the ES complex shifts the equilibrium towards the formation of ES (Le Chatelier’s principle), increasing the apparent affinity of the enzyme for the substrate. |
Lineweaver-Burk Plot |
The lines intersect at the same point on the y-axis (1/Vmax) but have different x-intercepts. |
The line obtained in the presence of the inhibitor is parallel to the line for the uninhibited reaction. |
Example |
Inhibition of succinate dehydrogenase by malonate . Malonate is structurally similar to the substrate, succinate. |
Inhibition of EPSP synthase by glyphosate (a herbicide). Glyphosate binds to the enzyme-substrate complex. |
(b) Ping-Pong Bi-Bi Reactions
A
ping-pong bi-bi reaction
, also known as a
double-displacement reaction
, is a type of multi-substrate enzyme reaction. Its defining characteristic is that one or more products are released before all the substrates have bound to the enzyme.
In this mechanism, the enzyme “pings and pongs” between two stable states.
Sequence of the Mechanism:
- The first substrate (A) binds to the enzyme (E), forming the EA complex.
- The enzyme temporarily accepts a functional group from A, leading to the release of the first product (P). In this process, the enzyme is converted into a modified, stable intermediate form (F). This is the “ping” step. E + A → EA → FP → F + P
- Now, the modified enzyme (F) binds the second substrate (B), forming the FB complex.
- The enzyme transfers the functional group it is holding onto B, creating the second product (Q). In this process, the enzyme is regenerated back to its original form (E). This is the “pong” step. F + B → FB → EQ → E + Q
A ternary complex, in which the enzyme is bound to both substrates simultaneously, is never formed in this mechanism.
Kinetic Signature:
The ping-pong mechanism has a distinctive kinetic signature when plotted on a
Lineweaver-Burk plot
(double reciprocal plot). When the concentration of one substrate is varied at several fixed concentrations of the other, the resulting lines are
parallel
. This distinguishes it from sequential mechanisms, where the lines intersect at a point.
Example:
Many
transaminases
, such as
Aspartate Transaminase
, and some oxidases follow a ping-pong mechanism. In aspartate transaminase, the enzyme (containing pyridoxal phosphate) accepts an amino group from the first substrate (e.g., aspartate), releasing the first product (oxaloacetate) and converting the enzyme to its modified pyridoxamine phosphate form. This modified enzyme then donates the amino group to the second substrate (α-ketoglutarate), forming the second product (glutamate) and regenerating the enzyme to its original state.
Q8. (a) Discuss the role of enzymes as diagnostics and as enzyme electrodes. (b) Write a brief note on Fisher’s lock and key hypothesis and illustrate with a suitable diagram.
Ans. (a) Role of Enzymes in Diagnostics and as Electrodes 1. Enzymes in Diagnostics (Enzyme Diagnostics): Clinical enzymology is a field of medicine that involves measuring the activity of enzymes in body fluids (primarily blood serum or plasma) to diagnose and monitor diseases. The principle is that many enzymes are concentrated within cells and are normally present in the blood in very low amounts. When a tissue is damaged due to disease or injury, its cells lyse and release their intracellular enzymes into the bloodstream, leading to an elevated concentration in the blood. Role and Examples:
- Heart Disease: To diagnose myocardial infarction (heart attack) , levels of creatine kinase (CK) , specifically its isoenzyme CK-MB , and lactate dehydrogenase (LDH-1) are measured. Elevated levels indicate damage to the heart muscle.
- Liver Disease: Levels of alanine aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST) are measured to detect hepatitis, cirrhosis, or other liver damage. Elevated ALT is quite specific for liver damage.
- Pancreatitis: Levels of amylase and lipase in the blood are measured to diagnose acute pancreatitis.
- Bone Disease and Prostate Cancer: Levels of alkaline phosphatase (ALP) can be elevated in bone diseases, while levels of acid phosphatase (ACP) are a marker for prostate cancer.
2. Enzyme Electrodes:
An enzyme electrode is a type of
biosensor
that uses the catalytic activity of an enzyme to measure the concentration of a specific substance. It consists of an
immobilized enzyme layer
coupled to the surface of an
electrochemical transducer
(e.g., a pH electrode, oxygen electrode).
Working Principle:
- The immobilized enzyme reacts with its specific substrate (the analyte).
- This reaction either produces a product or consumes a reactant that can be detected by the electrode (e.g., O₂, H⁺, H₂O₂, NH₃).
- The transducer converts this chemical change into a measurable electrical signal (e.g., current or voltage).
- The generated electrical signal is proportional to the concentration of the analyte.
Role and Example:
The most common example is the
glucose electrode
, used to measure blood glucose levels in diabetic patients.
- Enzyme: Glucose Oxidase (GOx)
- Reaction: Glucose + O₂ → Gluconic acid + H₂O₂
- Measurement: The electrode can measure either (a) the consumption of oxygen, (b) the production of hydrogen peroxide (H₂O₂), or (c) the change in pH. The resulting signal reflects the glucose concentration in the blood.
Enzyme electrodes are highly specific, sensitive, and are also used to measure many other compounds like urea, lactate, and cholesterol.
(b) Fisher’s Lock and Key Hypothesis
The
Lock and Key Hypothesis
was proposed by the German chemist
Emil Fischer
in 1894 to explain the specificity of enzyme-substrate interactions. It is one of the earliest models of enzyme action.
The Hypothesis:
According to this hypothesis, each enzyme has a specific, pre-formed, and rigid three-dimensional structure with an
active site
. The shape of this active site is precisely complementary to the shape of its specific substrate.
Fischer compared this interaction to a
lock
and its
key
:
- The enzyme is considered the lock .
- The substrate is considered the key .
Just as only a correctly shaped key can fit into and open a specific lock, only a correctly shaped substrate can fit into the rigid active site of the enzyme and induce a reaction. Any other molecule with a different shape will not be able to fit into the active site, which explains the high substrate specificity of enzymes.
Illustration:
(A simple diagram showing an enzyme (lock) with a ‘Y’-shaped groove (active site). A ‘Y’-shaped substrate (key) fits perfectly into this groove, while a square or round molecule cannot fit.)
Limitations:
Although this model successfully explains enzyme specificity, it is a static model and has certain limitations:
- It does not explain why the shape of the enzyme might change upon substrate binding, as has been observed in many cases.
- It fails to explain the dynamic process of catalysis and the stabilization of the transition state.
To overcome these limitations, the
Induced-Fit Model
was later proposed by Daniel Koshland, which suggests that the binding of the substrate induces a conformational change in the enzyme’s active site, which is necessary for catalysis.
Q9. (a) Explain with a suitable diagram the mechanism of action of lysozyme. (b) How does compartmentation of enzymes help in control of metabolic pathways ? Name two enzymes which are used as marker for mitochondria.
Ans. (a) Mechanism of Action of Lysozyme Lysozyme is an enzyme found in many organisms (e.g., in tears, saliva, egg white) that acts as an antibacterial agent by breaking down peptidoglycan, a major component of bacterial cell walls. It catalyzes the hydrolysis of the β(1→4) glycosidic bond between N-acetylmuramic acid (NAM) and N-acetylglucosamine (NAG) in peptidoglycan. The Mechanism (Phillips Mechanism): The mechanism of lysozyme was elucidated from its three-dimensional structure. The enzyme has a long cleft that serves as the active site and can bind a hexasaccharide unit of the peptidoglycan chain (named A-F). The bond cleavage occurs between sugar D (NAM) and E (NAG) . Two key amino acid residues play a crucial role in catalysis:
- Glutamate 35 (Glu-35): It is located in a non-polar environment, so it remains protonated (as COOH).
- Aspartate 52 (Asp-52): It is located in a polar environment, so it is deprotonated (as COO⁻).
Step-by-step process:
- General Acid Catalysis: Glu-35 acts as a general acid. It donates its proton to the glycosidic oxygen between sugars D and E, causing the C-O bond to break and releasing sugar E.
- Stabilization of the Oxocarbenium Ion: A transient, positively charged oxocarbenium ion intermediate is formed on sugar D. This intermediate is highly unstable, but the negative charge of Asp-52 electrostatically stabilizes it.
- Attack by Water Molecule: A water molecule (H₂O) enters the active site and nucleophilically attacks the oxocarbenium ion.
- General Base Catalysis: The now deprotonated Glu-35 (which is now COO⁻) acts as a general base. It accepts a proton from the water molecule, facilitating the formation of a hydroxyl group (OH) that attaches to sugar D.
At the end of this process, the glycosidic bond is cleaved, sugar D is released, and the enzyme (Glu-35 and Asp-52) is returned to its original state, ready for the next catalytic cycle.
(b) Compartmentation and Mitochondrial Markers
Role of Compartmentation in Control of Metabolic Pathways:
Compartmentation refers to the localization of specific metabolic pathways and enzymes within different organelles of eukaryotic cells, such as the mitochondria, cytosol, lysosomes, and endoplasmic reticulum. This is a fundamental strategy for the efficient control and regulation of metabolism.
Compartmentation helps in the following ways:
- Separation of Opposing Pathways: It keeps opposing metabolic pathways separate from each other. For example, fatty acid synthesis occurs in the cytosol , while fatty acid oxidation (β-oxidation) occurs in the mitochondria . This separation prevents a futile cycle where synthesis and degradation of a molecule occur simultaneously.
- Increased Local Concentration: It increases the local concentration of substrates, intermediates, and cofactors required for a specific pathway. This enhances the availability of substrates for enzymes and improves the overall efficiency of the reaction.
- Creation of Specialized Environments: Each organelle can provide a unique biochemical environment (e.g., pH, redox state) that is optimized for the reactions occurring there. For instance, the acidic environment of lysosomes (pH ~5) is optimal for hydrolytic enzymes.
- Efficient Regulation: By controlling the transport of metabolites between organelles, the cell can regulate overall metabolic flux. Membrane transport proteins act as critical control points of metabolism.
Marker Enzymes for Mitochondria:
Marker enzymes are enzymes that are specifically or predominantly localized to a particular cellular organelle. They are used to assess the purity of different fractions during cell fractionation.
Two major marker enzymes for mitochondria are:
- Succinate Dehydrogenase: This enzyme is tightly bound to the inner mitochondrial membrane . It is part of both the citric acid cycle and the electron transport chain.
- Citrate Synthase: This enzyme is located in the mitochondrial matrix and catalyzes the first step of the citric acid cycle.
Detecting the presence of these enzymes confirms the presence of mitochondria in a cell fraction.
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