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IGNOU MZO-005 Solved Question Paper PDF
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IGNOU MZO-005 Previous Year Solved Question Paper in Hindi
Q1. (a) स्तनधारी जीनोम पर एक संक्षिप्त टिप्पणी लिखिए। 5 (b) स्यूडोजीन को परिभाषित कीजिए और उनके प्रकारों पर चर्चा कीजिए। 5
Ans. (a) स्तनधारी जीनोम
स्तनधारी जीनोम, जो नाभिक और माइटोकॉन्ड्रिया में स्थित होता है, अरबों बेस पेयर (base pairs) से बना एक जटिल और विशाल आनुवंशिक खाका है। मानव जीनोम, एक विशिष्ट स्तनधारी जीनोम के रूप में, लगभग 3.2 बिलियन बेस पेयर का है।
स्तनधारी जीनोम की मुख्य विशेषताएँ निम्नलिखित हैं:
- आकार और संरचना: यह रैखिक गुणसूत्रों (linear chromosomes) में व्यवस्थित होता है जो नाभिक के भीतर रहते हैं। इसमें एक छोटा, गोलाकार माइटोकॉन्ड्रियल जीनोम भी होता है।
- C-वैल्यू पैराडॉक्स (C-value paradox): स्तनधारी जीनोम में बड़ी मात्रा में गैर-कोडिंग डीएनए होता है, जिसका अर्थ है कि जीनोम का आकार जीव की जटिलता से सीधे संबंधित नहीं है। मानव जीनोम का केवल 1.5-2% हिस्सा ही प्रोटीन को कोड करता है।
- गैर-कोडिंग डीएनए: जीनोम का अधिकांश भाग इंट्रॉन (introns), नियामक अनुक्रमों (regulatory sequences), और दोहराव वाले डीएनए (repetitive DNA) से बना है। दोहराव वाले डीएनए में ट्रांसपोसॉन (transposons) जैसे LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements) और SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) शामिल हैं, जो जीनोम के विकास और संरचना में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
- जीन घनत्व (Gene Density): बैक्टीरिया या यीस्ट जैसे सरल जीवों की तुलना में, स्तनधारी जीनोम में जीन घनत्व बहुत कम होता है। जीन बड़े होते हैं और लंबे इंट्रॉन द्वारा अलग किए जाते हैं।
- जीन परिवार (Gene Families): कई जीन डुप्लीकेशन (duplication) की घटनाओं के माध्यम से उत्पन्न हुए जीन परिवारों के हिस्से के रूप में मौजूद हैं, जैसे ग्लोबिन जीन परिवार।
मानव जीनोम परियोजना (Human Genome Project) ने स्तनधारी जीनोम की हमारी समझ में क्रांति ला दी है, जिससे बीमारियों के आनुवंशिक आधार और विकासवादी संबंधों में गहरी अंतर्दृष्टि प्राप्त हुई है।
(b) स्यूडोजीन और उनके प्रकार
स्यूडोजीन (Pseudogenes) जीनोम के भीतर डीएनए के अनुक्रम हैं जो अपने क्रियात्मक पूर्वज जीनों (functional ancestral genes) से मिलते-जुलते हैं, लेकिन उत्परिवर्तन (mutations) के संचय के कारण वे अक्रियात्मक या गैर-कार्यात्मक हो गए हैं। उन्हें “आनुवंशिक जीवाश्म” (genetic fossils) माना जाता है क्योंकि वे आणविक विकास का रिकॉर्ड प्रदान करते हैं।
स्यूडोजीन मुख्य रूप से तीन प्रकार के होते हैं:
- संसाधित स्यूडोजीन (Processed Pseudogenes): ये रेट्रोट्रांसपोजिशन (retrotransposition) नामक प्रक्रिया द्वारा बनते हैं। एक क्रियात्मक जीन का mRNA पहले रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन द्वारा पूरक डीएनए (cDNA) में परिवर्तित होता है। यह cDNA फिर जीनोम में एक नए स्थान पर डाला जाता है। चूंकि वे mRNA मध्यवर्ती से उत्पन्न होते हैं, इसलिए संसाधित स्यूडोजीन में उनके मूल जीन में पाए जाने वाले इंट्रॉन (introns) की कमी होती है और अक्सर उनके अंत में एक पॉली-ए टेल (poly-A tail) होती है। उनके पास आमतौर पर अपस्ट्रीम प्रमोटर अनुक्रम नहीं होते हैं, इसलिए वे ट्रांसक्राइब नहीं होते हैं।
- गैर-संसाधित स्यूडोजीन (Non-processed Pseudogenes): इन्हें डुप्लीकेटेड स्यूडोजीन (duplicated pseudogenes) भी कहा जाता है। ये जीन डुप्लीकेशन (gene duplication) या असमान क्रॉसिंग-ओवर (unequal crossing-over) के परिणामस्वरूप उत्पन्न होते हैं। प्रारंभ में, डुप्लीकेटेड कॉपी क्रियात्मक हो सकती है, लेकिन समय के साथ, यह उत्परिवर्तन (जैसे फ्रेमशिफ्ट, नॉनसेंस म्यूटेशन) जमा कर सकती है जो इसे गैर-कार्यात्मक बना देते हैं। संसाधित स्यूडोजीन के विपरीत, इनमें इंट्रॉन और फ्लैंकिंग नियामक तत्व होते हैं, ठीक उनके क्रियात्मक समकक्षों की तरह।
- अक्षम या यूनिटरी स्यूडोजीन (Disabled or Unitary Pseudogenes): यह एक ऐसा जीन है जो डुप्लीकेट नहीं हुआ है और अपनी मूल जीनोमिक स्थिति में उत्परिवर्तन के माध्यम से निष्क्रिय हो गया है। ऐसा जीन किसी आबादी के सभी सदस्यों में क्रियात्मक हो सकता है, लेकिन किसी एक व्यक्ति में यह एक स्यूडोजीन बन सकता है। यदि यह गैर-कार्यात्मक एलील आबादी में स्थिर हो जाता है, तो यह एक यूनिटरी स्यूडोजीन बन जाता है।
Q2. (a) मानव रोग के लिए -ओमिक्स के विभिन्न अनुप्रयोगों की गणना कीजिए। 5 (b) प्रोटीओम के खनन से क्या तात्पर्य है? प्रोटीओम खनन रणनीति पर चर्चा कीजिए। 5
Ans. (a) मानव रोग के लिए -ओमिक्स के अनुप्रयोग
“-ओमिक्स” प्रौद्योगिकियाँ (जैसे जीनोमिक्स, प्रोटिओमिक्स, ट्रांसक्रिप्टोमिक्स, मेटाबोलोमिक्स) जैविक अणुओं के बड़े सेटों का व्यापक विश्लेषण करती हैं और मानव रोगों की हमारी समझ और प्रबंधन में क्रांति ला रही हैं। मुख्य अनुप्रयोग निम्नलिखित हैं:
- जीनोमिक्स (Genomics): यह जीनोम के अध्ययन से संबंधित है।
- रोग संवेदनशीलता की पहचान: जीनोम-वाइड एसोसिएशन स्टडीज (GWAS) विशिष्ट आनुवंशिक वेरिएंट (जैसे SNPs) को मधुमेह, हृदय रोग और कैंसर जैसी जटिल बीमारियों के बढ़ते जोखिम से जोड़ते हैं।
- फार्माकोजेनोमिक्स (Pharmacogenomics): यह किसी व्यक्ति की आनुवंशिक रूपरेखा के आधार पर दवा की प्रतिक्रिया की भविष्यवाणी करता है, जिससे व्यक्तिगत दवा (personalized medicine) का विकास संभव होता है, जिससे प्रभावकारिता बढ़ती है और प्रतिकूल प्रभाव कम होते हैं।
- कैंसर जीनोमिक्स: ट्यूमर के जीनोम का अनुक्रमण उन चालक उत्परिवर्तनों (driver mutations) की पहचान करता है जिन्हें लक्षित उपचारों (targeted therapies) से निशाना बनाया जा सकता है (जैसे, स्तन कैंसर में HER2)।
- ट्रांसक्रिप्टोमिक्स (Transcriptomics): यह आरएनए ट्रांसक्रिप्ट के सेट (ट्रांसक्रिप्टोम) का अध्ययन करता है। आरएनए-सीक्वेंसिंग (RNA-Seq) जैसी तकनीकें विभिन्न ऊतकों या रोग अवस्थाओं में जीन अभिव्यक्ति पैटर्न को मापती हैं, जिससे रोग तंत्र और संभावित बायोमार्कर की पहचान होती है।
- प्रोटिओमिक्स (Proteomics): यह प्रोटीन (प्रोटीओम) के बड़े पैमाने पर अध्ययन पर केंद्रित है।
- बायोमार्कर खोज: मास स्पेक्ट्रोमेट्री का उपयोग करके, वैज्ञानिक रक्त या ऊतकों में उन प्रोटीनों की पहचान कर सकते हैं जिनकी मात्रा रोग की उपस्थिति में बदल जाती है (जैसे, प्रोस्टेट कैंसर के लिए PSA)। ये निदान और पूर्वानुमान के लिए महत्वपूर्ण हैं।
- दवा लक्ष्य की पहचान: प्रोटिओमिक्स उन प्रोटीनों को उजागर कर सकता है जो रोग प्रक्रियाओं में केंद्रीय भूमिका निभाते हैं और नई दवाओं के लिए लक्ष्य के रूप में काम कर सकते हैं।
- मेटाबोलोमिक्स (Metabolomics): यह छोटे अणुओं या मेटाबोलाइट्स (मेटाबोलोम) का अध्ययन करता है। चयापचय प्रोफाइल में परिवर्तन रोग की स्थिति का एक संवेदनशील संकेतक हो सकता है और जन्मजात चयापचय त्रुटियों (inborn errors of metabolism) के निदान में मदद कर सकता है।
(b) प्रोटीओम खनन और इसकी रणनीति
प्रोटीओम खनन (Proteome Mining) एक जैविक नमूने (जैसे सेल, ऊतक, या जीव) में मौजूद प्रोटीन के संपूर्ण सेट (प्रोटीओम) की व्यापक पहचान, मात्रा का ठहराव और कार्यात्मक लक्षण वर्णन की प्रक्रिया है। इसका लक्ष्य केवल यह जानना नहीं है कि कौन से प्रोटीन मौजूद हैं, बल्कि उनकी प्रचुरता, संशोधन (modifications), अंतःक्रियाएं (interactions) और उपकोशिकीय स्थान (subcellular location) को भी समझना है।
प्रोटीओम खनन रणनीति (Proteome Mining Strategy) में आम तौर पर निम्नलिखित चरण शामिल होते हैं:
- नमूना तैयार करना और प्रोटीन निष्कर्षण (Sample Preparation and Protein Extraction): यह एक महत्वपूर्ण कदम है। लक्ष्य विश्लेषण के लिए प्रासंगिक प्रोटीनों को कुशलतापूर्वक निकालना है, जबकि संदूषकों को हटाना है। कोशिकाओं या ऊतकों को लाइसिस बफर का उपयोग करके तोड़ा जाता है, और प्रोटीनों को घुलनशील बनाया जाता है।
- प्रोटीन पृथक्करण (Protein Separation): जटिल प्रोटीन मिश्रण को अलग-अलग घटकों में अलग करने की आवश्यकता होती है। सबसे आम तकनीकें हैं:
- द्वि-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन (2-D Gel Electrophoresis – 2-DE): प्रोटीन को पहले उनके आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु (pI) के आधार पर और फिर उनके आणविक भार (molecular weight) के आधार पर अलग किया जाता है।
- तरल क्रोमैटोग्राफी (Liquid Chromatography – LC): विशेष रूप से, मल्टी-डायमेंशनल प्रोटीन आइडेंटिफिकेशन टेक्नोलॉजी (MudPIT) जैसी तकनीकें, जहां पेप्टाइड्स को मास स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवेश करने से पहले कई क्रोमैटोग्राफी चरणों के माध्यम से अलग किया जाता है।
- मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा पहचान (Identification by Mass Spectrometry – MS): अलग किए गए प्रोटीनों (या उनके एंजाइमेटिक रूप से पचाए गए पेप्टाइड्स) का विश्लेषण मास स्पेक्ट्रोमेट्री द्वारा किया जाता है। दो मुख्य आयनीकरण तकनीकें हैं:
- MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)
- ESI (Electrospray Ionization)
मास स्पेक्ट्रोमीटर पेप्टाइड्स के द्रव्यमान-से-आवेश अनुपात (mass-to-charge ratio) को मापता है। टेंडेम मास स्पेक्ट्रोमेट्री (MS/MS) में, विशिष्ट पेप्टाइड्स को और खंडित किया जाता है ताकि उनका अमीनो एसिड अनुक्रम निर्धारित किया जा सके।
- डेटाबेस खोज और जैव सूचना विज्ञान (Database Searching and Bioinformatics): उत्पन्न MS/MS डेटा (स्पेक्ट्रा) का उपयोग प्रोटीन डेटाबेस (जैसे, Swiss-Prot, NCBInr) में खोज करने के लिए किया जाता है। MASCOT या SEQUEST जैसे एल्गोरिदम प्रायोगिक स्पेक्ट्रा का डेटाबेस में मौजूद सैद्धांतिक पेप्टाइड स्पेक्ट्रा से मिलान करते हैं, जिससे प्रोटीन की पहचान होती है। इस चरण में मात्रात्मक विश्लेषण और पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों का एनोटेशन भी शामिल है।
Q3. (a) चक्र प्रतिवर्ती समापन (CRT) प्रौद्योगिकी के चरणों की रूपरेखा तैयार कीजिए। 5 (b) प्रोटीन की तृतीयक संरचना की भविष्यवाणी के लिए उपलब्ध उपकरणों पर चर्चा कीजिए। 5
Ans. (a) चक्र प्रतिवर्ती समापन (Cycle Reversible Termination – CRT) प्रौद्योगिकी के चरण
चक्र प्रतिवर्ती समापन (CRT) प्रौद्योगिकी, जिसे sequencing-by-synthesis (SBS) भी कहा जाता है, Illumina द्वारा विकसित अगली पीढ़ी की अनुक्रमण (Next-Generation Sequencing – NGS) प्लेटफार्मों का आधार है। यह तकनीक एक समय में एक न्यूक्लियोटाइड को शामिल करके लाखों डीएनए टुकड़ों को समानांतर में अनुक्रमित करने की अनुमति देती है।
CRT प्रक्रिया में निम्नलिखित चरण होते हैं:
- पुस्तकालय तैयारी और क्लस्टर जनरेशन (Library Preparation and Cluster Generation): डीएनए नमूने को छोटे टुकड़ों में तोड़ा जाता है, और एडेप्टर (adapters) को सिरों पर जोड़ा जाता है। इन एकल-रज्जुक टुकड़ों को एक फ्लो सेल (flow cell) की सतह पर स्थिर किया जाता है, जो ओलिगोन्यूक्लियोटाइड से ढकी होती है। ब्रिज एम्प्लीफिकेशन (bridge amplification) नामक प्रक्रिया के माध्यम से, प्रत्येक टुकड़ा एक ही स्थान पर हजारों समान प्रतियों का एक क्लस्टर बनाता है।
- अनुक्रमण रसायन का जोड़ (Addition of Sequencing Reagents): फ्लो सेल में एक अनुक्रमण प्राइमर, डीएनए पोलीमरेज़, और चार प्रकार के विशेष न्यूक्लियोटाइड (A, T, C, G) जोड़े जाते हैं। प्रत्येक न्यूक्लियोटाइड को एक अद्वितीय फ्लोरोसेंट डाई (fluorescent dye) और एक प्रतिवर्ती टर्मिनेटर (reversible terminator) समूह के साथ संशोधित किया जाता है। यह टर्मिनेटर समूह पोलीमरेज़ को एक से अधिक न्यूक्लियोटाइड जोड़ने से रोकता है।
- न्यूक्लियोटाइड निगमन (Nucleotide Incorporation): डीएनए पोलीमरेज़ प्रत्येक क्लस्टर में टेम्पलेट स्ट्रैंड के पूरक पहले न्यूक्लियोटाइड को जोड़ता है। चूंकि प्रतिवर्ती टर्मिनेटर मौजूद है, प्रति चक्र केवल एक बेस जोड़ा जाता है।
- इमेजिंग (Imaging): अतिरिक्त न्यूक्लियोटाइड को धो दिया जाता है। फिर एक लेजर फ्लो सेल को उत्तेजित करता है, जिससे प्रत्येक क्लस्टर में शामिल न्यूक्लियोटाइड से जुड़ी फ्लोरोसेंट डाई चमकने लगती है। एक उच्च-रिज़ॉल्यूशन कैमरा इस संकेत को कैप्चर करता है, और प्रत्येक क्लस्टर का रंग (और इस प्रकार बेस) दर्ज किया जाता है।
- समापन और डाई का विदलन (Cleavage of Terminator and Dye): एक रासायनिक प्रक्रिया का उपयोग प्रतिवर्ती टर्मिनेटर समूह और फ्लोरोसेंट डाई को नए शामिल किए गए न्यूक्लियोटाइड से हटाने के लिए किया जाता है। यह स्ट्रैंड के 3′-OH सिरे को पुन: उत्पन्न करता है, जिससे यह अगले निगमन चरण के लिए तैयार हो जाता है।
- चक्र की पुनरावृत्ति (Repeat Cycle): चरण 2 से 5 को बार-बार दोहराया जाता है (सैकड़ों बार)। प्रत्येक चक्र में, एक और बेस जोड़ा जाता है और उसकी छवि ली जाती है। इस प्रकार, समय के साथ प्रत्येक क्लस्टर से उत्पन्न होने वाले रंगों का क्रम डीएनए टुकड़े के अनुक्रम को प्रकट करता है।
(b) प्रोटीन की तृतीयक संरचना भविष्यवाणी के लिए उपकरण
प्रोटीन की तृतीयक (3D) संरचना की भविष्यवाणी करना, केवल उसके अमीनो एसिड अनुक्रम से, संरचनात्मक जीव विज्ञान में एक मौलिक चुनौती है। प्रायोगिक तरीके जैसे एक्स-रे क्रिस्टलोग्राफी और एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी महंगे और समय लेने वाले हैं। कम्प्यूटेशनल उपकरण तेजी से महत्वपूर्ण विकल्प प्रदान करते हैं। मुख्य भविष्यवाणी विधियाँ और उनके उपकरण हैं:
- समरूपता मॉडलिंग (Homology Modeling):
- सिद्धांत: यह विधि इस तथ्य पर आधारित है कि समान अनुक्रम वाले प्रोटीन समान संरचनाएं अपनाते हैं। यदि लक्ष्य प्रोटीन (जिसकी संरचना अज्ञात है) का एक ज्ञात संरचना वाला होमोलॉगस प्रोटीन (टेम्पलेट) है, तो टेम्पलेट संरचना का उपयोग लक्ष्य के लिए एक मॉडल बनाने के लिए किया जा सकता है। यह सबसे विश्वसनीय कम्प्यूटेशनल विधि है, बशर्ते एक अच्छा टेम्पलेट (>30% अनुक्रम पहचान) उपलब्ध हो।
- उपकरण: SWISS-MODEL एक लोकप्रिय, उपयोग में आसान वेब सर्वर है जो स्वचालित रूप से टेम्पलेट्स ढूंढता है और मॉडल बनाता है। MODELLER एक अधिक शक्तिशाली और अनुकूलन योग्य स्टैंडअलोन प्रोग्राम है।
- थ्रेडिंग या फोल्ड रिकग्निशन (Threading or Fold Recognition):
- सिद्धांत: इस विधि का उपयोग तब किया जाता है जब कोई स्पष्ट होमोलॉगस टेम्पलेट उपलब्ध नहीं होता है। यह ज्ञात प्रोटीन संरचनाओं (फोल्ड्स) के पुस्तकालय के खिलाफ लक्ष्य अनुक्रम को “थ्रेड” करके काम करता है और यह आकलन करता है कि कौन सा फोल्ड अनुक्रम के लिए सबसे उपयुक्त है। यह दूर के विकासवादी संबंधों का पता लगा सकता है जहां अनुक्रम समानता कम हो गई है लेकिन संरचनात्मक फोल्ड संरक्षित है।
- उपकरण: Phyre2 (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) एक प्रसिद्ध वेब सर्वर है जो समरूपता मॉडलिंग और थ्रेडिंग दोनों का उपयोग करता है।
- एब इनिटियो या डी नोवो मॉडलिंग (Ab Initio or de novo Modeling):
- सिद्धांत: यह विधि किसी टेम्पलेट संरचना पर निर्भर नहीं करती है। इसके बजाय, यह भौतिकी के पहले सिद्धांतों (जैसे थर्मोडायनामिक्स और ऊर्जा न्यूनतमकरण) का उपयोग करके जमीन से संरचना की भविष्यवाणी करने का प्रयास करती है। ये विधियाँ कम्प्यूटेशनल रूप से बहुत गहन हैं और आमतौर पर छोटे प्रोटीनों के लिए उपयोग की जाती हैं या बड़ी संरचनाओं के उन हिस्सों को मॉडल करने के लिए उपयोग की जाती हैं जहां टेम्पलेट जानकारी की कमी होती है।
- उपकरण: Rosetta इस क्षेत्र में सबसे सफल सॉफ्टवेयर सूट में से एक है, जो प्रोटीन संरचना की भविष्यवाणी और डिजाइन के लिए एल्गोरिदम का उपयोग करता है।
- आर्टिफिशियल इंटेलिजेंस (AI) आधारित उपकरण: हाल ही में, AlphaFold2 (DeepMind द्वारा) और RoseTTAFold जैसे AI-संचालित उपकरणों ने अभूतपूर्व सटीकता का प्रदर्शन किया है, जो अक्सर प्रायोगिक परिणामों के बराबर होती है। ये उपकरण डीप लर्निंग का उपयोग करते हैं और अनुक्रम जानकारी, একাধিক अनुक्रम संरेखण (multiple sequence alignments), और ज्ञात संरचनाओं के विशाल डेटाबेस से सीखते हैं ताकि अत्यधिक सटीक मॉडल बना सकें, जिससे यह क्षेत्र बदल गया है।
Q4. (a) सप्रेशन सबट्रैक्टिव हाइब्रिडाइजेशन के मूल सिद्धांत को योजनाबद्ध आरेख के साथ रेखांकित कीजिए। 5 (b) आरएनए-सीक विश्लेषण पर एक स्पष्ट आरेख के साथ संक्षिप्त टिप्पणी लिखिए। 5
Ans. (a) सप्रेशन सबट्रैक्टिव हाइब्रिडाइजेशन (Suppression Subtractive Hybridization – SSH)
सिद्धांत:
सप्रेशन सबट्रैक्टिव हाइब्रिडाइजेशन (SSH) एक शक्तिशाली आणविक तकनीक है जिसका उपयोग दो अलग-अलग आबादी (जैसे, रोगग्रस्त बनाम स्वस्थ ऊतक, या उपचारित बनाम अनुपचारित कोशिकाएं) के बीच भिन्न रूप से व्यक्त जीन (differentially expressed genes) को अलग करने के लिए किया जाता है। इसका मुख्य लक्ष्य उन जीनों (या mRNA) की पहचान करना है जो एक नमूने (जिसे ‘टेस्टर’ कहा जाता है) में मौजूद हैं लेकिन दूसरे नमूने (‘ड्राइवर’) में नहीं हैं या बहुत कम स्तर पर हैं।
यह तकनीक संकरण (hybridization) और पीसीआर (PCR) के सिद्धांतों को जोड़ती है। मुख्य विचार ‘टेस्टर’ और ‘ड्राइवर’ आबादी से cDNA का संकरण करना है। संकरण के बाद, दोनों नमूनों में समान रूप से मौजूद अनुक्रम डबल-स्ट्रैंडेड हाइब्रिड बनाएंगे, जबकि ‘टेस्टर’ के लिए अद्वितीय अनुक्रम सिंगल-स्ट्रैंडेड रहेंगे। एक चतुर ‘सप्रेशन पीसीआर’ तकनीक का उपयोग तब इन अद्वितीय, सिंगल-स्ट्रैंडेड अणुओं को चुनिंदा रूप से प्रवर्धित करने के लिए किया जाता है।
कार्यविधि के चरण:
- cDNA संश्लेषण: दो स्रोतों से mRNA निकाला जाता है – ‘टेस्टर’ (जिसमें रुचि के जीन हैं) और ‘ड्राइवर’ (संदर्भ नमूना)। दोनों से cDNA संश्लेषित किया जाता है।
- एडेप्टर लिगेशन: टेस्टर cDNA को दो भागों में विभाजित किया जाता है और प्रत्येक भाग में अलग-अलग एडेप्टर (Adapter 1 और Adapter 2R) जोड़े जाते हैं।
- पहला संकरण: अतिरिक्त मात्रा में ड्राइवर cDNA को दोनों टेस्टर नमूनों में मिलाया जाता है और मिश्रण को विकृत (denature) और फिर संकरित (hybridize) किया जाता है। इस चरण में, टेस्टर में मौजूद अधिकांश सामान्य जीन ड्राइवर cDNA के साथ हाइब्रिड हो जाते हैं। टेस्टर-विशिष्ट जीन सिंगल-स्ट्रैंडेड रहते हैं।
- दूसरा संकरण: दो अलग-अलग संकरण प्रतिक्रियाओं को अब मिलाया जाता है। उन्हें फिर से विकृत और संकरित किया जाता है। यह चरण यह सुनिश्चित करता है कि शेष सभी सिंगल-स्ट्रैंडेड टेस्टर cDNA एक-दूसरे के साथ हाइब्रिड हों। इसके परिणामस्वरूप ऐसे अणु बनते हैं जिनके दोनों सिरों पर अलग-अलग एडेप्टर होते हैं।
- सप्रेशन पीसीआर: अब, मिश्रण पर पीसीआर किया जाता है। केवल उन टेस्टर cDNA अणुओं का प्रवर्धन होता है जिनके दोनों सिरों पर अलग-अलग एडेप्टर (एक तरफ एडेप्टर 1 और दूसरी तरफ एडेप्टर 2R) होते हैं। समान एडेप्टर वाले अणु एक ‘पैन-हैंडल’ जैसी संरचना बनाते हैं जो पीसीआर प्रवर्धन को दबा देती है (इसलिए ‘सप्रेशन’ नाम)। ड्राइवर cDNA और सामान्य cDNA में एडेप्टर नहीं होते हैं, इसलिए उनका भी प्रवर्धन नहीं होता है।
- विश्लेषण: प्रवर्धित उत्पादों को क्लोन किया जाता है और अनुक्रमित किया जाता है ताकि भिन्न रूप से व्यक्त जीनों की पहचान की जा सके।
[यहां एक योजनाबद्ध आरेख बनाया जाना चाहिए जो टेस्टर और ड्राइवर की तैयारी, एडेप्टर लिगेशन, दो संकरण चरणों और चयनात्मक पीसीआर प्रवर्धन को दर्शाता हो।]
(b) आरएनए-सीक विश्लेषण (RNA-Seq Analysis)
सिद्धांत:
आरएनए-सीक्वेंसिंग (RNA-Seq) एक अगली पीढ़ी की अनुक्रमण (NGS) तकनीक है जो एक जैविक नमूने में आरएनए की उपस्थिति और मात्रा को प्रकट करती है। यह ट्रांसक्रिप्टोम (transcriptome) का एक अत्यधिक संवेदनशील और सटीक स्नैपशॉट प्रदान करता है। माइक्रोएरे के विपरीत, आरएनए-सीक को पूर्व ज्ञान की आवश्यकता नहीं होती है और यह ज्ञात और उपन्यास दोनों ट्रांसक्रिप्ट की पहचान कर सकता है, साथ ही स्प्लिस वेरिएंट, छोटे आरएनए और जीन फ्यूजन का भी पता लगा सकता है।
विश्लेषण कार्यप्रवाह:
आरएनए-सीक विश्लेषण में कई चरण शामिल होते हैं, जिन्हें मोटे तौर पर तीन भागों में विभाजित किया जा सकता है: प्री-प्रोसेसिंग, मैपिंग और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण।
- पुस्तकालय तैयारी (Library Preparation):
- आरएनए निष्कर्षण: कोशिकाओं या ऊतकों से कुल आरएनए निकाला जाता है।
- आरएनए चयन: आमतौर पर, पॉली (ए) चयन का उपयोग करके mRNA को समृद्ध किया जाता है या राइबोसोमल आरएनए (rRNA) को हटा दिया जाता है, क्योंकि rRNA कुल आरएनए का ~90% होता है।
- विखंडन और cDNA संश्लेषण: आरएनए को छोटे टुकड़ों में तोड़ा जाता है। फिर रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज़ का उपयोग करके इसे पूरक डीएनए (cDNA) में परिवर्तित किया जाता है।
- एडेप्टर लिगेशन: अनुक्रमण के लिए आवश्यक विशेष एडेप्टर cDNA टुकड़ों के सिरों पर जोड़े जाते हैं।
- अनुक्रमण (Sequencing): तैयार cDNA पुस्तकालय को Illumina जैसे NGS प्लेटफॉर्म पर अनुक्रमित किया जाता है, जो लाखों छोटी रीड्स (short reads) उत्पन्न करता है।
- डेटा विश्लेषण (Data Analysis):
- गुणवत्ता नियंत्रण (Quality Control): कच्ची रीड्स का गुणवत्ता मूल्यांकन किया जाता है, और खराब गुणवत्ता वाले बेस या एडेप्टर अनुक्रमों को हटा दिया जाता है (ट्रिमिंग)।
- संरेखण/मैपिंग (Alignment/Mapping): गुणवत्ता-नियंत्रित रीड्स को एक संदर्भ जीनोम (reference genome) या ट्रांसक्रिप्टोम के साथ संरेखित किया जाता है। HISAT2 या STAR जैसे उपकरण इस चरण के लिए उपयोग किए जाते हैं।
- मात्रा का ठहराव (Quantification): प्रत्येक जीन या ट्रांसक्रिप्ट से उत्पन्न होने वाली रीड्स की संख्या गिनी जाती है। यह उस जीन के अभिव्यक्ति स्तर का एक माप है। परिणाम RPKM, FPKM, या TPM जैसी इकाइयों में व्यक्त किए जाते हैं।
- विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण (Differential Expression Analysis): विभिन्न नमूनों (जैसे, उपचारित बनाम नियंत्रण) के बीच जीन अभिव्यक्ति में सांख्यिकीय रूप से महत्वपूर्ण अंतर की पहचान करने के लिए DESeq2 या edgeR जैसे सांख्यिकीय उपकरणों का उपयोग किया जाता है।
- आगे का विश्लेषण: इसमें जीन सेट संवर्धन विश्लेषण (gene set enrichment analysis), पाथवे विश्लेषण, और स्प्लिस वेरिएंट की पहचान शामिल हो सकती है।
[यहां एक प्रवाह आरेख बनाया जाना चाहिए जो आरएनए निष्कर्षण से लेकर विभेदक अभिव्यक्ति विश्लेषण तक के चरणों को दर्शाता हो।]
Q5. उचित आरेख के साथ प्रोटीन अनुक्रमण की एडमैन डिग्रेडेशन तकनीक पर चर्चा कीजिए। इस तकनीक के फायदे और नुकसान का उल्लेख कीजिए। 10
Ans.
एडमैन डिग्रेडेशन तकनीक (Edman Degradation Technique)
एडमैन डिग्रेडेशन, जिसे पीहर एडमैन द्वारा 1950 के दशक में विकसित किया गया था, एक प्रोटीन या पेप्टाइड के एन-टर्मिनल (N-terminal) से अमीनो एसिड अनुक्रम को निर्धारित करने के लिए एक क्लासिक विधि है। यह एक चक्रीय प्रक्रिया है जिसमें एक समय में एक अमीनो एसिड को N-टर्मिनस से क्रमिक रूप से हटाया और पहचाना जाता है।
सिद्धांत और प्रक्रिया:
यह प्रक्रिया तीन मुख्य चरणों के एक चक्र पर आधारित है: कपलिंग (coupling), क्लीवेज (cleavage), और कन्वर्जन (conversion) ।
चरण 1: कपलिंग (Coupling)
- इस चरण में, प्रोटीन या पेप्टाइड को हल्के क्षारीय माध्यम (pH ~9.0) में फेनिलआइसोथियोसाइनेट (Phenylisothiocyanate – PITC) , जिसे एडमैन रिएजेंट भी कहा जाता है, के साथ प्रतिक्रिया कराई जाती है।
- PITC का फेनिलआइसोथियोसाइनेट समूह प्रोटीन के N-टर्मिनल सिरे पर स्थित अनावेशित अल्फा-अमीनो समूह (α-amino group) के साथ एक सहसंयोजक बंधन बनाता है।
- इस प्रतिक्रिया के परिणामस्वरूप एक फेनिलथियोकार्बामॉयल (phenylthiocarbamoyl – PTC) व्युत्पन्न बनता है, जिसे PTC-प्रोटीन कहा जाता है।
चरण 2: क्लीवेज (Cleavage)
- PTC-प्रोटीन वाले मिश्रण को निर्जल ट्राइफ्लोरोएसिटिक एसिड (anhydrous trifluoroacetic acid – TFA) जैसे मजबूत एसिड से उपचारित किया जाता है।
- यह एसिडिक वातावरण पहले और दूसरे अमीनो एसिड के बीच के पेप्टाइड बंधन को चुनिंदा रूप से तोड़ता है।
- इसके परिणामस्वरूप N-टर्मिनल अमीनो एसिड एक एनिलिनोथियाज़ोलिनोन (anilinothiazolinone – ATZ) व्युत्पन्न के रूप में मुक्त होता है, जबकि शेष पेप्टाइड (जो अब एक अमीनो एसिड छोटा है) अक्षुण्ण रहता है।
चरण 3: कन्वर्जन और पहचान (Conversion and Identification)
- ATZ-अमीनो एसिड व्युत्पन्न अस्थिर होता है और इसे सीधे पहचाना नहीं जा सकता है। इसलिए, इसे एक जलीय एसिड के साथ उपचारित करके एक अधिक स्थिर फेनिलथियोहाइडेंटोइन (phenylthiohydantoin – PTH) व्युत्पन्न में परिवर्तित किया जाता है।
- प्रत्येक अमीनो एसिड का अपना अनूठा PTH व्युत्पन्न होता है जिसकी एक विशिष्ट साइड चेन (R-ग्रुप) होती है।
- इस PTH-अमीनो एसिड को फिर उच्च-प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (High-Performance Liquid Chromatography – HPLC) या गैस क्रोमैटोग्राफी का उपयोग करके पहचाना जाता है। ज्ञात PTH-अमीनो एसिड मानकों के रिटेंशन टाइम के साथ तुलना करके इसकी पहचान की जाती है।
शेष पेप्टाइड (अब एक अमीनो एसिड छोटा) को फिर से कपलिंग चरण से शुरू करके एडमैन डिग्रेडेशन के अगले चक्र के लिए उपयोग किया जाता है। इस चक्र को दोहराकर, पेप्टाइड के अनुक्रम को N-टर्मिनस से क्रमिक रूप से निर्धारित किया जा सकता है।
[यहां एडमैन डिग्रेडेशन के रासायनिक प्रतिक्रिया चक्र का एक आरेख बनाया जाना चाहिए। आरेख में PITC का N-टर्मिनल अमीनो समूह के साथ जुड़ना, TFA द्वारा क्लीवेज से ATZ व्युत्पन्न का बनना, और फिर PTH व्युत्पन्न में रूपांतरण दिखाया जाना चाहिए।]
एडमैन डिग्रेडेशन के फायदे (Advantages):
- उच्च सटीकता: यह पहले 30-50 अमीनो एसिड के लिए बहुत सटीक और विश्वसनीय अनुक्रम डेटा प्रदान करता है।
- सु-स्थापित विधि: यह एक क्लासिक और अच्छी तरह से समझी गई तकनीक है।
- मात्रात्मक: PTH-व्युत्पन्नों की मात्रा को मापा जा सकता है, जो प्रत्येक स्थिति में मौजूद अमीनो एसिड की मात्रा के बारे में जानकारी दे सकता है।
एडमैन डिग्रेडेशन के नुकसान (Disadvantages):
- लंबाई की सीमा: प्रत्येक चक्र में अपूर्ण प्रतिक्रियाओं के कारण, दक्षता 100% नहीं होती है (आमतौर पर >98%)। इस संचयी अशुद्धि के कारण, यह तकनीक लगभग 50-60 अमीनो एसिड से अधिक लंबे पेप्टाइड्स के लिए प्रभावी नहीं है।
- धीमी प्रक्रिया: प्रत्येक चक्र में लगभग एक घंटा लगता है, इसलिए एक छोटे पेप्टाइड को अनुक्रमित करने में कई दिन लग सकते हैं।
- अवरुद्ध एन-टर्मिनस (Blocked N-terminus): यदि पेप्टाइड का N-टर्मिनस स्वाभाविक रूप से संशोधित (जैसे एसिटिलीकरण) होता है, तो PITC प्रतिक्रिया नहीं कर सकता है, और तकनीक विफल हो जाती है।
- नमूना शुद्धता: इसके लिए अत्यधिक शुद्ध प्रोटीन या पेप्टाइड नमूने की आवश्यकता होती है। मिश्रण से अस्पष्ट परिणाम मिलेंगे।
- संसाधन-गहन: इसके लिए विशेष उपकरण (एक स्वचालित सीक्वेनेटर) और महंगे रसायनों की आवश्यकता होती है।
Q6. प्रोटीन के 2-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन के विभिन्न अनुप्रयोगों और उपयोगिताओं पर चर्चा कीजिए। 10
Ans.
2-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन (2-Dimensional Gel Electrophoresis – 2-DE)
2-आयामी जेल वैद्युतकणसंचलन (2-DE या 2D-PAGE) एक अत्यंत शक्तिशाली प्रोटीओमिक्स तकनीक है जिसका उपयोग एक जटिल मिश्रण (जैसे, सेल लाइसेट, ऊतक अर्क) में हजारों प्रोटीनों को अलग करने और उनकी कल्पना करने के लिए किया जाता है। यह तकनीक प्रोटीनों को दो स्वतंत्र भौतिक गुणों के आधार पर अलग करती है, जिससे पारंपरिक एक-आयामी SDS-PAGE की तुलना में बहुत अधिक विभेदन क्षमता (resolution) प्राप्त होती है।
सिद्धांत:
- प्रथम आयाम: आइसोइलेक्ट्रिक फोकसिंग (Isoelectric Focusing – IEF): इस चरण में, प्रोटीन मिश्रण को एक स्थिर pH प्रवणता वाली जेल स्ट्रिप (IPG स्ट्रिप) पर लोड किया जाता है। जब एक विद्युत क्षेत्र लागू किया जाता है, तो प्रोटीन pH प्रवणता के साथ तब तक गति करते हैं जब तक कि वे उस बिंदु पर नहीं पहुंच जाते जहां pH उनके आइसोइलेक्ट्रिक बिंदु (pI) के बराबर होता है। pI पर, प्रोटीन पर शुद्ध आवेश शून्य होता है और वह गति करना बंद कर देता है। इस प्रकार, प्रोटीन अपने pI के आधार पर अलग हो जाते हैं।
- द्वितीय आयाम: SDS-पॉलीएक्रिलामाइड जेल वैद्युतकणसंचलन (SDS-PAGE): IEF स्ट्रिप को फिर एक मानक SDS-पॉलीएक्रिलामाइड स्लैब जेल के शीर्ष पर रखा जाता है। SDS (सोडियम डोडेसिल सल्फेट) एक डिटर्जेंट है जो प्रोटीनों को विकृत करता है और उन्हें एक समान नकारात्मक आवेश प्रदान करता है। जब विद्युत क्षेत्र लागू किया जाता है, तो SDS-लेपित प्रोटीन अपने आणविक भार (molecular weight) के आधार पर जेल के माध्यम से गति करते हैं – छोटे प्रोटीन बड़े प्रोटीन की तुलना में तेजी से आगे बढ़ते हैं।
परिणामस्वरूप एक 2D जेल प्राप्त होता है जहां प्रत्येक प्रोटीन स्पॉट एक अद्वितीय (pI, आणविक भार) समन्वय पर स्थित होता है। इन स्पॉट्स को Coomassie Blue, सिल्वर स्टेनिंग, या फ्लोरोसेंट रंगों का उपयोग करके देखा जा सकता है।
2-DE के अनुप्रयोग और उपयोगिताएँ:
2-DE की उच्च विभेदन क्षमता इसे प्रोटीओमिक्स अनुसंधान में कई अनुप्रयोगों के लिए एक अमूल्य उपकरण बनाती है:
- प्रोटीओम प्रोफाइलिंग (Proteome Profiling): 2-DE का सबसे आम उपयोग विभिन्न जैविक अवस्थाओं के बीच प्रोटीओम की तुलना करना है। उदाहरण के लिए, वैज्ञानिक एक स्वस्थ ऊतक के प्रोटीन प्रोफाइल की तुलना एक रोगग्रस्त ऊतक से कर सकते हैं ताकि यह देख सकें कि कौन से प्रोटीन की अभिव्यक्ति बदल गई है। इससे रोग के आणविक आधार को समझने में मदद मिलती है।
- बायोमार्कर खोज (Biomarker Discovery): कैंसर, न्यूरोडीजेनेरेटिव विकारों या संक्रामक रोगों जैसी विभिन्न बीमारियों में, कुछ प्रोटीनों का स्तर बढ़ या घट सकता है। 2-DE का उपयोग करके विभिन्न नमूनों (जैसे, रक्त सीरम, सेरेब्रोस्पाइनल द्रव) की तुलना करके, इन परिवर्तित प्रोटीनों की पहचान की जा सकती है। ये प्रोटीन रोग के निदान, पूर्वानुमान या उपचार की प्रतिक्रिया के लिए संभावित बायोमार्कर के रूप में काम कर सकते हैं।
- पोस्ट-ट्रांसलेशनल संशोधनों (Post-Translational Modifications – PTMs) का विश्लेषण: PTMs जैसे फॉस्फोराइलेशन, ग्लाइकोसिलेशन, या एसिटिलीकरण एक प्रोटीन के pI और/या आणविक भार को बदल सकते हैं। 2-DE में, एक ही प्रोटीन के विभिन्न संशोधित रूप (आइसोफॉर्म) जेल पर अलग-अलग स्थानों पर दिखाई देंगे, जो अक्सर क्षैतिज या ऊर्ध्वाधर “ट्रेन” या स्पॉट्स के समूह के रूप में दिखते हैं। यह शोधकर्ताओं को PTMs की स्थिति का अध्ययन करने और सेलुलर सिग्नलिंग जैसी प्रक्रियाओं में उनकी भूमिका को समझने की अनुमति देता है।
- दवा के प्रभाव का अध्ययन: कोशिकाओं या जीवों को किसी दवा से उपचारित करने के बाद, 2-DE का उपयोग प्रोटीओम पर उस दवा के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए किया जा सकता है। इससे दवा की क्रिया के तंत्र को समझने और ऑफ-टारगेट प्रभावों की पहचान करने में मदद मिल सकती है।
- प्रोटीन शुद्धिकरण और पहचान: 2-DE जेल पर रुचि के प्रोटीन स्पॉट को भौतिक रूप से काटा जा सकता है। फिर इस स्पॉट से प्रोटीन को निकालकर मास स्पेक्ट्रोमेट्री (Mass Spectrometry) जैसी तकनीकों का उपयोग करके उसकी पहचान की जा सकती है। यह जीन अभिव्यक्ति डेटा को मान्य करने या नए पहचाने गए प्रोटीन के कार्य का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है।
- जैविक उत्पादों की गुणवत्ता नियंत्रण: दवा उद्योग में, 2-DE का उपयोग चिकित्सीय प्रोटीन (जैसे, एंटीबॉडी) के बैचों की शुद्धता और स्थिरता का आकलन करने के लिए किया जा सकता है, यह सुनिश्चित करते हुए कि उत्पाद में सही आइसोफॉर्म हैं और कोई अवांछित संदूषक नहीं हैं।
इन व्यापक अनुप्रयोगों के बावजूद, 2-DE श्रम-साध्य है और झिल्ली प्रोटीन जैसे कुछ प्रकार के प्रोटीनों के लिए कम उपयुक्त है। हालाँकि, यह वैश्विक प्रोटीन अभिव्यक्ति विश्लेषण के लिए एक आधारभूत तकनीक बनी हुई है।
Q7. निम्नलिखित पर एक संक्षिप्त विवरण लिखिए: (प्रत्येक 2½ अंक) (a) माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस का जीनोम विश्लेषण (b) प्रतिबंधन एंजाइमों के सामान्य गुण (c) रिपोर्टर जीन (d) फेज डिस्प्ले तकनीक
Ans.
(a) माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस का जीनोम विश्लेषण
माइकोबैक्टीरियम ट्यूबरकुलोसिस (Mtb), तपेदिक (tuberculosis) का कारक एजेंट, का एक गोलाकार जीनोम है जो लगभग 4.4 मिलियन बेस पेयर (Mb) लंबा है और इसमें लगभग 4,000 जीन होते हैं। इसके जीनोम की एक प्रमुख विशेषता इसका उच्च G+C सामग्री (लगभग 65.6%) है। जीनोम विश्लेषण से Mtb के जीव विज्ञान और इसकी रोगजनकता के बारे में महत्वपूर्ण जानकारी मिली है। इसमें लिपिड चयापचय (lipid metabolism) में शामिल जीनों का एक बड़ा अनुपात है, जो इसकी जटिल, लिपिड-समृद्ध कोशिका भित्ति के संश्लेषण के लिए महत्वपूर्ण है, जिसमें माइकोलिक एसिड (mycolic acids) शामिल हैं। यह कोशिका भित्ति बैक्टीरिया को मेजबान की प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया और एंटीबायोटिक दवाओं से बचाती है। जीनोम में PE/PPE जीन परिवार जैसे कई जीन भी होते हैं, जो प्रतिजनी भिन्नता (antigenic variation) में भूमिका निभाते हैं, जिससे बैक्टीरिया प्रतिरक्षा प्रणाली से बच सकता है। जीनोम अनुक्रमण ने दवा प्रतिरोधी उपभेदों में उत्परिवर्तन की पहचान करने में मदद की है (जैसे, रिफैम्पिसिन प्रतिरोध के लिए rpoB जीन में) और नए दवा लक्ष्यों की पहचान के लिए आधार प्रदान किया है।
(b) प्रतिबंधन एंजाइमों के सामान्य गुण
प्रतिबंधन एंजाइम (Restriction enzymes), जिन्हें प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिज़ (restriction endonucleases) भी कहा जाता है, वे प्रोटीन हैं जो डीएनए को विशिष्ट पहचान अनुक्रमों पर काटते हैं। वे प्राकृतिक रूप से बैक्टीरिया में पाए जाते हैं, जहां वे विदेशी डीएनए (जैसे, बैक्टीरियोफेज से) के खिलाफ एक रक्षा तंत्र के रूप में कार्य करते हैं। उनके सामान्य गुण निम्नलिखित हैं:
- विशिष्टता (Specificity): प्रत्येक प्रतिबंधन एंजाइम एक बहुत ही विशिष्ट, छोटे डीएनए अनुक्रम को पहचानता है और काटता है, जिसे प्रतिबंधन स्थल (restriction site) कहा जाता है। ये स्थल आमतौर पर 4 से 8 बेस पेयर लंबे होते हैं।
- पैलिंड्रोमिक अनुक्रम (Palindromic Sequences): अधिकांश प्रतिबंधन स्थल पैलिंड्रोमिक होते हैं, जिसका अर्थ है कि 5′ से 3′ दिशा में एक स्ट्रैंड पर अनुक्रम विपरीत स्ट्रैंड पर 5′ से 3′ दिशा में अनुक्रम के समान होता है (जैसे, EcoRI के लिए GAATTC)।
- कटाई के प्रकार (Types of Cut): एंजाइम डीएनए को दो तरीकों से काट सकते हैं: (i) चिपचिपे सिरे (Sticky Ends) बनाना, जहां वे दोनों स्ट्रैंड्स को अलग-अलग बिंदुओं पर काटते हैं, जिससे सिंगल-स्ट्रैंडेड ओवरहैंग्स बनते हैं। (ii) कुंद सिरे (Blunt Ends) बनाना, जहां वे दोनों स्ट्रैंड्स को एक ही बिंदु पर काटते हैं।
- इष्टतम स्थितियाँ: प्रत्येक एंजाइम की गतिविधि के लिए विशिष्ट स्थितियाँ (तापमान, pH और Mg 2+ जैसे सहकारकों की सांद्रता) की आवश्यकता होती है।
इन गुणों के कारण, वे आणविक क्लोनिंग, डीएनए मैपिंग और जेनेटिक इंजीनियरिंग में अनिवार्य उपकरण हैं।
(c) रिपोर्टर जीन
एक रिपोर्टर जीन एक ऐसा जीन है जिसे शोधकर्ता एक नियामक अनुक्रम (regulatory sequence) या किसी अन्य जीन से जोड़ते हैं, जिसकी वे रुचि रखते हैं। रिपोर्टर जीन का उत्पाद आसानी से पता लगाने योग्य और मापने योग्य होता है, और यह उस नियामक अनुक्रम की गतिविधि या जुड़े हुए प्रोटीन के स्थान के बारे में “रिपोर्ट” करता है। उनका उपयोग जीन अभिव्यक्ति, प्रमोटर की ताकत और प्रोटीन स्थानीयकरण का अध्ययन करने के लिए किया जाता है। सामान्य रिपोर्टर जीन में शामिल हैं:
- GFP (Green Fluorescent Protein): यह प्रोटीन नीली रोशनी के तहत हरी चमकता है। इसका उपयोग जीवित कोशिकाओं में प्रोटीन को टैग करने और उनकी गति और स्थान को ट्रैक करने के लिए किया जाता है।
- LUC (Luciferase): यह एंजाइम अपने सब्सट्रेट (लूसिफेरिन) की उपस्थिति में प्रकाश उत्पन्न करता है। उत्पादित प्रकाश की मात्रा को मापकर जीन अभिव्यक्ति के स्तर को बहुत संवेदनशील तरीके से निर्धारित किया जा सकता है।
- lacZ (जो β-galactosidase को कूटबद्ध करता है): यह एंजाइम X-gal नामक एक रंगहीन सब्सट्रेट को नीले रंग के उत्पाद में बदल देता है, जिससे व्यक्त करने वाली कोशिकाओं की आसान पहचान हो जाती है।
- CAT (Chloramphenicol Acetyltransferase): यह एक एंजाइम है जिसकी गतिविधि को रेडियोधर्मी परख के माध्यम से मापा जा सकता है।
(d) फेज डिस्प्ले तकनीक
फेज डिस्प्ले एक शक्तिशाली आणविक जीव विज्ञान तकनीक है जो बैक्टीरियोफेज (एक वायरस जो बैक्टीरिया को संक्रमित करता है) की सतह पर पेप्टाइड्स या प्रोटीनों को प्रदर्शित करने के लिए उपयोग की जाती है। तकनीक इस सिद्धांत पर काम करती है कि रुचि के प्रोटीन को कूटबद्ध करने वाले जीन को फेज के एक कोट प्रोटीन (coat protein) जीन के साथ जोड़ा जाता है। जब इस संशोधित फेज जीनोम को बैक्टीरिया में व्यक्त किया जाता है, तो उत्पन्न होने वाले फेज कणों की सतह पर रुचि का प्रोटीन (कोट प्रोटीन के हिस्से के रूप में) प्रदर्शित होता है। महत्वपूर्ण रूप से, प्रत्येक फेज कण के भीतर वह जीन होता है जो उस प्रोटीन को कूटबद्ध करता है जिसे वह प्रदर्शित कर रहा है।
इस तकनीक का उपयोग बड़े पेप्टाइड या प्रोटीन पुस्तकालयों को बनाने और उन्हें एक विशिष्ट लक्ष्य अणु (जैसे, एक रिसेप्टर या एंटीबॉडी) के खिलाफ जांचने (screen) के लिए किया जाता है। इस प्रक्रिया को बायोपैनिंग (biopanning) कहा जाता है, जिसमें लक्ष्य से बंधने वाले फेज को चुना और समृद्ध किया जाता है। इसके मुख्य अनुप्रयोगों में एंटीबॉडी इंजीनियरिंग, दवा खोज (drug discovery), और प्रोटीन-प्रोटीन अंतःक्रियाओं का अध्ययन शामिल है।
IGNOU MZO-005 Previous Year Solved Question Paper in English
Q1. (a) Write a brief note on mammalian genome. 5 (b) Define pseudogenes and discuss their types. 5
Ans. (a) Mammalian Genome The mammalian genome, housed in the nucleus and mitochondria, is a complex and vast genetic blueprint composed of billions of base pairs. The human genome, as a representative mammalian genome, is approximately 3.2 billion base pairs in size. Key features of the mammalian genome include:
- Size and Structure: It is organized into linear chromosomes that reside within the nucleus. It also includes a small, circular mitochondrial genome.
- C-value paradox: The mammalian genome contains a large amount of non-coding DNA, meaning the genome size does not directly correlate with the organism’s complexity. Only about 1.5-2% of the human genome codes for proteins.
- Non-coding DNA: The majority of the genome is made up of introns, regulatory sequences, and repetitive DNA. The repetitive DNA includes transposons like LINEs (Long Interspersed Nuclear Elements) and SINEs (Short Interspersed Nuclear Elements) , which have played a significant role in genome evolution and structure.
- Gene Density: Compared to simpler organisms like bacteria or yeast, the gene density in mammalian genomes is very low. Genes are large and are separated by long introns and intergenic regions.
- Gene Families: Many genes exist as part of gene families that have arisen through duplication events, such as the globin gene family.
The Human Genome Project has revolutionized our understanding of the mammalian genome, providing deep insights into the genetic basis of diseases and evolutionary relationships.
(b)
Pseudogenes and their types
Pseudogenes
are sequences of DNA within the genome that resemble their functional ancestral genes but have become inactivated or non-functional due to the accumulation of mutations. They are considered “genetic fossils” as they provide a record of molecular evolution.
There are three main types of pseudogenes:
- Processed Pseudogenes: These are formed through a process called retrotransposition . An mRNA from a functional gene is first reverse-transcribed into complementary DNA (cDNA). This cDNA is then inserted into a new location in the genome. Because they originate from an mRNA intermediate, processed pseudogenes lack the introns found in their parent gene and often have a poly-A tail at their end. They usually do not have upstream promoter sequences, so they are not transcribed.
- Non-processed Pseudogenes: Also known as duplicated pseudogenes , these arise as a result of gene duplication or unequal crossing-over. Initially, the duplicated copy may be functional, but over time, it can accumulate mutations (e.g., frameshifts, nonsense mutations) that render it non-functional. Unlike processed pseudogenes, they retain the intron-exon structure and flanking regulatory elements, just like their functional counterparts.
- Disabled or Unitary Pseudogenes: This is a gene that has not been duplicated and has become inactivated in its original genomic location through mutations. Such a gene may be functional in all members of a population, but in a single individual, it can become a pseudogene. If this non-functional allele becomes fixed in the population, it becomes a unitary pseudogene.
Q2. (a) Enumerate the different applications of -omics to human disease. 5 (b) What is meant by mining of proteome ? Discuss the proteome mining strategy. 5
Ans. (a) Applications of -omics to Human Disease The “-omics” technologies (e.g., genomics, proteomics, transcriptomics, metabolomics) comprehensively analyze large sets of biological molecules and are revolutionizing our understanding and management of human diseases. The key applications are:
- Genomics: This deals with the study of the genome.
- Identifying Disease Susceptibility: Genome-Wide Association Studies (GWAS) link specific genetic variants (like SNPs) to an increased risk of complex diseases like diabetes, heart disease, and cancer.
- Pharmacogenomics: It predicts drug response based on an individual’s genetic profile, enabling personalized medicine, which increases efficacy and reduces adverse effects.
- Cancer Genomics: Sequencing the genome of tumors identifies driver mutations that can be targeted by specific therapies (e.g., HER2 in breast cancer).
- Transcriptomics: This studies the set of RNA transcripts (the transcriptome). Techniques like RNA-sequencing (RNA-Seq) measure gene expression patterns in different tissues or disease states, helping to identify disease mechanisms and potential biomarkers.
- Proteomics: This focuses on the large-scale study of proteins (the proteome).
- Biomarker Discovery: Using mass spectrometry, scientists can identify proteins in blood or tissues whose levels change with the presence of a disease (e.g., PSA for prostate cancer). These are crucial for diagnosis and prognosis.
- Drug Target Identification: Proteomics can highlight proteins that play a central role in disease processes and can serve as targets for new drugs.
- Metabolomics: This studies small molecules or metabolites (the metabolome). Changes in metabolic profiles can be a sensitive indicator of a disease state and can help in diagnosing inborn errors of metabolism.
(b)
Proteome Mining and its Strategy
Proteome mining
is the process of comprehensively identifying, quantifying, and functionally characterizing the entire set of proteins (the proteome) present in a biological sample (e.g., a cell, tissue, or organism). The goal is not just to know which proteins are present, but also to understand their abundance, modifications, interactions, and subcellular location.
The
Proteome Mining Strategy
typically involves the following steps:
- Sample Preparation and Protein Extraction: This is a critical step. The goal is to efficiently extract the proteins relevant to the analysis while removing contaminants. Cells or tissues are broken open using a lysis buffer, and the proteins are solubilized.
- Protein Separation: The complex mixture of proteins needs to be separated into individual components. The most common techniques are:
- 2-D Gel Electrophoresis (2-DE): Proteins are separated first based on their isoelectric point (pI) and then on their molecular weight.
- Liquid Chromatography (LC): Particularly techniques like Multi-dimensional Protein Identification Technology (MudPIT), where peptides are separated through multiple chromatography steps before entering the mass spectrometer.
- Identification by Mass Spectrometry (MS): The separated proteins (or their enzymatically digested peptides) are analyzed by mass spectrometry. Two main ionization techniques are:
- MALDI (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization)
- ESI (Electrospray Ionization)
The mass spectrometer measures the mass-to-charge ratio of the peptides. In tandem mass spectrometry (MS/MS), specific peptides are further fragmented to determine their amino acid sequence.
- Database Searching and Bioinformatics: The generated MS/MS data (spectra) are used to search protein databases (e.g., Swiss-Prot, NCBInr). Algorithms like MASCOT or SEQUEST match the experimental spectra against theoretical peptide spectra in the database, leading to protein identification. This step also includes quantitative analysis and annotation of post-translational modifications.
Q3. (a) Outline the steps of Cycle Reversible Termination (CRT) technology. 5 (b) Discuss the tools available for tertiary structure prediction of proteins. 5
Ans. (a) Steps of Cycle Reversible Termination (CRT) Technology Cycle Reversible Termination (CRT) technology, also known as sequencing-by-synthesis (SBS) , is the foundation of Next-Generation Sequencing (NGS) platforms developed by Illumina . The technology allows for the parallel sequencing of millions of DNA fragments by incorporating one nucleotide at a time. The CRT process consists of the following steps:
- Library Preparation and Cluster Generation: The DNA sample is fragmented, and adapters are ligated to the ends. These single-stranded fragments are immobilized on the surface of a flow cell, which is coated with oligonucleotides. Through a process called bridge amplification, each fragment creates a cluster of thousands of identical copies in one spot.
- Addition of Sequencing Reagents: A sequencing primer, DNA polymerase, and four types of special nucleotides (A, T, C, G) are added to the flow cell. Each nucleotide is modified with a unique fluorescent dye and a reversible terminator group. This terminator group prevents the polymerase from adding more than one nucleotide.
- Nucleotide Incorporation: The DNA polymerase adds the first complementary nucleotide to the template strand in each cluster. Because the reversible terminator is present, only a single base is added per cycle.
- Imaging: Unincorporated nucleotides are washed away. A laser then excites the flow cell, causing the fluorescent dye attached to the incorporated nucleotide in each cluster to emit light. A high-resolution camera captures this signal, and the color (and thus the base) of each cluster is recorded.
- Cleavage of Terminator and Dye: A chemical process is used to remove the reversible terminator group and the fluorescent dye from the newly incorporated nucleotide. This regenerates the 3′-OH group of the strand, making it ready for the next incorporation step.
- Repeat Cycle: Steps 2 through 5 are repeated many times (hundreds of cycles). In each cycle, another base is added and imaged. The sequence of colors generated from each cluster over time thus reveals the sequence of the DNA fragment.
(b)
Tools for Tertiary Structure Prediction of Proteins
Predicting the tertiary (3D) structure of a protein from its amino acid sequence alone is a fundamental challenge in structural biology. Experimental methods like X-ray crystallography and NMR spectroscopy are expensive and time-consuming. Computational tools provide increasingly vital alternatives. The main prediction methods and their tools are:
- Homology Modeling:
- Principle: This method is based on the fact that proteins with similar sequences adopt similar structures. If a target protein (whose structure is unknown) has a homologous protein with a known structure (the template), the template’s structure can be used to build a model for the target. It is the most reliable computational method, provided a good template (>30% sequence identity) is available.
- Tools: SWISS-MODEL is a popular, easy-to-use web server that automates finding templates and building models. MODELLER is a more powerful and customizable standalone program.
- Threading or Fold Recognition:
- Principle: This method is used when no obvious homologous template is available. It works by “threading” the target sequence against a library of known protein structures (folds) and assessing which fold is the best fit for the sequence. It can detect distant evolutionary relationships where sequence similarity has degraded but the structural fold is conserved.
- Tool: Phyre2 (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) is a well-known web server that uses both homology modeling and threading.
- Ab Initio or de novo Modeling:
- Principle: This method does not rely on a template structure. Instead, it attempts to predict the structure from the ground up using the first principles of physics (e.g., thermodynamics and energy minimization). These methods are computationally very intensive and are typically used for small proteins or to model parts of larger structures where template information is lacking.
- Tool: Rosetta is one of the most successful software suites in this area, using algorithms for protein structure prediction and design.
- Artificial Intelligence (AI)-based Tools: Recently, AI-powered tools like AlphaFold2 (by DeepMind) and RoseTTAFold have demonstrated unprecedented accuracy, often on par with experimental results. These tools use deep learning and learn from vast databases of sequence information, multiple sequence alignments, and known structures to generate highly accurate models, transforming the field.
Q4. (a) Outline the basic principle of suppression subtractive hybridization with schematic diagram. 5 (b) Write a brief note on RNA-Seq Analysis with clear diagram. 5
Ans. (a) Suppression Subtractive Hybridization (SSH) Principle: Suppression Subtractive Hybridization (SSH) is a powerful molecular technique used to isolate differentially expressed genes between two different populations (e.g., diseased vs. healthy tissue, or treated vs. untreated cells). Its main goal is to identify genes (or mRNAs) that are present in one sample (the ‘tester’ ) but absent or at a much lower level in another (the ‘driver’). The technique combines the principles of hybridization and PCR. The key idea is to hybridize cDNA from the ‘tester’ and ‘driver’ populations. After hybridization, sequences that are common to both samples will form double-stranded hybrids, while sequences unique to the ‘tester’ will remain single-stranded. A clever ‘suppression PCR’ technique is then used to selectively amplify these unique, single-stranded molecules. Steps of the procedure:
- cDNA Synthesis: mRNA is extracted from two sources – the ‘tester’ (containing the genes of interest) and the ‘driver’ (the reference sample). cDNA is synthesized from both.
- Adapter Ligation: The tester cDNA is split into two, and different adapters (Adapter 1 and Adapter 2R) are ligated to each half.
- First Hybridization: An excess of driver cDNA is added to both tester samples, and the mixture is denatured and then allowed to hybridize. In this step, most of the common genes in the tester hybridize with the driver cDNA. The tester-specific genes remain single-stranded.
- Second Hybridization: The two separate hybridization reactions are now mixed together. They are again denatured and allowed to hybridize. This step ensures that any remaining single-stranded tester cDNA will hybridize with each other, creating molecules that have different adapters at each end.
- Suppression PCR: PCR is now performed on the mixture. Only those tester cDNA molecules that have different adapters at each end (Adapter 1 on one side, Adapter 2R on the other) will be amplified exponentially. Molecules with the same adapter on both ends form a ‘pan-handle’ like structure that suppresses PCR amplification (hence the name ‘suppression’). The driver cDNA and common cDNAs do not have adapters and are not amplified.
- Analysis: The amplified products are cloned and sequenced to identify the differentially expressed genes.
[A schematic diagram should be drawn here illustrating the preparation of tester and driver, adapter ligation, the two hybridization steps, and the selective PCR amplification.]
(b)
RNA-Seq Analysis
Principle:
RNA-sequencing (RNA-Seq) is a next-generation sequencing (NGS) technique that reveals the presence and quantity of RNA in a biological sample. It provides a highly sensitive and accurate snapshot of the transcriptome. Unlike microarrays, RNA-Seq does not require prior knowledge and can identify both known and novel transcripts, as well as detect splice variants, small RNAs, and gene fusions.
Analysis Workflow:
The RNA-Seq analysis involves several steps, which can be broadly divided into pre-processing, mapping, and downstream analysis.
- Library Preparation:
- RNA extraction: Total RNA is extracted from cells or tissues.
- RNA selection: Typically, mRNA is enriched using poly(A) selection, or ribosomal RNA (rRNA) is depleted, as rRNA constitutes ~90% of total RNA.
- Fragmentation and cDNA synthesis: The RNA is fragmented into smaller pieces. It is then converted into complementary DNA (cDNA) using reverse transcriptase.
- Adapter ligation: Special adapters required for sequencing are ligated to the ends of the cDNA fragments.
- Sequencing: The prepared cDNA library is sequenced on an NGS platform like Illumina, generating millions of short reads.
- Data Analysis:
- Quality Control (QC): Raw reads are assessed for quality, and low-quality bases or adapter sequences are removed (trimming).
- Alignment/Mapping: The quality-controlled reads are aligned to a reference genome or transcriptome. Tools like HISAT2 or STAR are used for this step.
- Quantification: The number of reads originating from each gene or transcript is counted. This is a measure of that gene’s expression level. Results are expressed in units like RPKM, FPKM, or TPM.
- Differential Expression Analysis: Statistical tools like DESeq2 or edgeR are used to identify statistically significant differences in gene expression between different samples (e.g., treated vs. control).
- Further Analysis: This can include gene set enrichment analysis, pathway analysis, and identification of splice variants.
[A flowchart should be drawn here illustrating the steps from RNA extraction to differential expression analysis.]
Q5. Discuss with proper diagram, the technique of Edman degradation of protein sequencing. Mention the advantages and disadvantages of this technique. 10
Ans. Edman Degradation Technique Edman degradation, developed by Pehr Edman in the 1950s, is a classic method for determining the amino acid sequence from the N-terminal end of a protein or peptide. It is a cyclical process involving the sequential removal and identification of one amino acid at a time from the N-terminus. Principle and Procedure: The procedure is based on a cycle of three main steps: coupling, cleavage, and conversion . Step 1: Coupling
- In this step, the protein or peptide is reacted with Phenylisothiocyanate (PITC) , also known as Edman’s reagent, in a mildly alkaline medium (pH ~9.0).
- The phenylisothiocyanate group of PITC forms a covalent bond with the uncharged α-amino group located at the N-terminal end of the protein.
- This reaction results in the formation of a phenylthiocarbamoyl (PTC) derivative, called PTC-protein.
Step 2: Cleavage
- The mixture containing the PTC-protein is treated with a strong anhydrous acid, such as anhydrous trifluoroacetic acid (TFA).
- This acidic environment selectively breaks the peptide bond between the first and second amino acids.
- This results in the release of the N-terminal amino acid as an anilinothiazolinone (ATZ) derivative, while the rest of the peptide (now one amino acid shorter) remains intact.
Step 3: Conversion and Identification
- The ATZ-amino acid derivative is unstable and cannot be identified directly. Therefore, it is converted into a more stable phenylthiohydantoin (PTH) derivative by treating it with an aqueous acid.
- Each amino acid has its own unique PTH derivative with a characteristic side chain (R-group).
- This PTH-amino acid is then identified using High-Performance Liquid Chromatography (HPLC) or gas chromatography. It is identified by comparing its retention time to that of known PTH-amino acid standards.
The remaining peptide (now one amino acid shorter) is subjected to the next cycle of Edman degradation, starting again with the coupling step. By repeating this cycle, the sequence of the peptide can be determined sequentially from the N-terminus.
[A diagram of the chemical reaction cycle of Edman degradation should be drawn here. The diagram should show the coupling of PITC to the N-terminal amino group, the cleavage by TFA to form the ATZ derivative, and then the conversion to the PTH derivative.]
Advantages of Edman Degradation:
- High Accuracy: It provides very accurate and reliable sequence data for the first 30-50 amino acids.
- Well-established Method: It is a classic and well-understood technique.
- Quantitative: The amount of PTH-derivative can be measured, which can give information on the quantity of amino acid present at each position.
Disadvantages of Edman Degradation:
- Length Limitation: Due to incomplete reactions in each cycle, the efficiency is not 100% (typically >98%). This cumulative inefficiency means the technique is not effective for peptides longer than about 50-60 amino acids.
- Slow Process: Each cycle takes about one hour, so sequencing a short peptide can take several days.
- Blocked N-terminus: If the N-terminus of the peptide is naturally modified (e.g., by acetylation), PITC cannot react, and the technique fails.
- Sample Purity: It requires a highly purified protein or peptide sample. A mixture will yield ambiguous results.
- Resource-intensive: It requires specialized equipment (an automated sequencer) and expensive chemicals.
Q6. Discuss the different applications and utilities of 2-dimensional gel electrophoresis of proteins. 10
Ans. 2-Dimensional Gel Electrophoresis (2-DE) 2-Dimensional Gel Electrophoresis (2-DE or 2D-PAGE) is a highly powerful proteomics technique used to separate and visualize thousands of proteins within a complex mixture (e.g., cell lysate, tissue extract). The technique separates proteins based on two independent physical properties, leading to a much higher resolution than conventional one-dimensional SDS-PAGE. Principle:
- First Dimension: Isoelectric Focusing (IEF): In this step, the protein mixture is loaded onto a gel strip (IPG strip) containing a stable pH gradient. When an electric field is applied, proteins migrate along the pH gradient until they reach the point where the pH equals their isoelectric point (pI) . At the pI, the net charge on the protein is zero, and it stops moving. Thus, proteins are separated based on their pI.
- Second Dimension: SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE): The IEF strip is then placed on top of a standard SDS-polyacrylamide slab gel. SDS (sodium dodecyl sulfate) is a detergent that denatures the proteins and coats them with a uniform negative charge. When an electric field is applied, the SDS-coated proteins migrate through the gel based on their molecular weight —smaller proteins move faster than larger ones.
The result is a 2D gel where each protein spot is located at a unique (pI, molecular weight) coordinate. The spots can be visualized using stains like Coomassie Blue, silver staining, or fluorescent dyes.
Applications and Utilities of 2-DE:
The high resolution of 2-DE makes it an invaluable tool for numerous applications in proteomics research:
- Proteome Profiling: The most common use of 2-DE is to compare the proteomes between different biological states. For instance, scientists can compare the protein profile of a healthy tissue versus a diseased tissue to see which proteins have altered expression. This helps in understanding the molecular basis of the disease.
- Biomarker Discovery: In various diseases like cancer, neurodegenerative disorders, or infectious diseases, the levels of certain proteins can be up- or down-regulated. By comparing different samples (e.g., blood serum, cerebrospinal fluid) using 2-DE, these altered proteins can be identified. These proteins can serve as potential biomarkers for diagnosis, prognosis, or response to treatment.
- Analysis of Post-Translational Modifications (PTMs): PTMs like phosphorylation, glycosylation, or acetylation can alter the pI and/or molecular weight of a protein. In 2-DE, different modified forms (isoforms) of the same protein will appear at different spots on the gel, often as horizontal or vertical “trains” or clusters of spots. This allows researchers to study the status of PTMs and understand their role in processes like cellular signaling.
- Study of Drug Effects: After treating cells or organisms with a drug, 2-DE can be used to analyze the effect of that drug on the proteome. This can help elucidate the drug’s mechanism of action and identify off-target effects.
- Protein Purification and Identification: A protein spot of interest on a 2-DE gel can be physically excised. The protein can then be eluted from the spot and identified using techniques like Mass Spectrometry. This is a crucial step for validating gene expression data or for studying the function of a newly identified protein.
- Quality Control of Biologics: In the pharmaceutical industry, 2-DE can be used to assess the purity and consistency of batches of therapeutic proteins (e.g., antibodies), ensuring that the product has the correct isoforms and no unwanted contaminants.
Despite these wide-ranging applications, 2-DE is laborious and is less suitable for certain types of proteins like membrane proteins. However, it remains a cornerstone technique for global protein expression analysis.
Q7. Write a short account on the following : (2½ marks each) (a) Genome analysis of Mycobacterium tuberculosis (b) General properties of restriction enzymes (c) Reporter genes (d) Phage display technique
Ans. (a) Genome analysis of Mycobacterium tuberculosis Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis, has a circular genome of about 4.4 million base pairs (Mb) containing around 4,000 genes. A key feature of its genome is its high G+C content (approx. 65.6%) . Genome analysis has revealed critical insights into Mtb’s biology and its pathogenicity. It has a large proportion of genes involved in lipid metabolism, which is crucial for the synthesis of its complex, lipid-rich cell wall containing mycolic acids. This cell wall protects the bacterium from the host’s immune response and antibiotics. The genome also contains numerous genes, like the PE/PPE gene families , that play a role in antigenic variation, allowing the bacterium to evade the immune system. Genome sequencing has helped identify mutations in drug-resistant strains (e.g., in the rpoB gene for rifampicin resistance) and provided the basis for identifying new drug targets. (b) General properties of restriction enzymes Restriction enzymes, also called restriction endonucleases, are proteins that cut DNA at specific recognition sequences. They are found naturally in bacteria, where they act as a defense mechanism against foreign DNA (e.g., from bacteriophages). Their general properties are:
- Specificity: Each restriction enzyme recognizes and cuts a very specific, short DNA sequence, called a restriction site . These sites are typically 4 to 8 base pairs long.
- Palindromic Sequences: Most restriction sites are palindromic, meaning the sequence on one strand in the 5′ to 3′ direction is the same as the sequence on the opposite strand in the 5′ to 3′ direction (e.g., GAATTC for EcoRI).
- Types of Cut: The enzymes can cut DNA in two ways: (i) creating Sticky Ends , where they cut both strands at different points, leaving single-stranded overhangs. (ii) creating Blunt Ends , where they cut both strands at the same point.
- Optimal Conditions: Each enzyme requires specific conditions (temperature, pH, and concentration of cofactors like Mg 2+ ) for its activity.
These properties make them indispensable tools in molecular cloning, DNA mapping, and genetic engineering.
(c) Reporter genes
A reporter gene is a gene that researchers attach to a regulatory sequence or another gene of interest. The product of the reporter gene is easily detectable and measurable, and it “reports” on the activity of the regulatory sequence or the location of the fused protein. They are used to study gene expression, promoter strength, and protein localization. Common reporter genes include:
- GFP (Green Fluorescent Protein): This protein glows green under blue light. It is used to tag proteins and track their movement and location within living cells.
- LUC (Luciferase): This enzyme generates light in the presence of its substrate (luciferin). The level of gene expression can be quantified with great sensitivity by measuring the amount of light produced.
- lacZ (which encodes β-galactosidase): This enzyme converts a colorless substrate, X-gal, into a blue-colored product, allowing for easy identification of expressing cells.
- CAT (Chloramphenicol Acetyltransferase): This is an enzyme whose activity can be measured via a radioactive assay.
(d) Phage display technique
Phage display is a powerful molecular biology technique used to display peptides or proteins on the surface of a bacteriophage (a virus that infects bacteria). The technique works by fusing the gene encoding the protein of interest to the gene of a phage coat protein. When this modified phage genome is expressed in bacteria, the resulting phage particles display the protein of interest on their surface (as part of the coat protein). Crucially, each phage particle contains within it the gene that encodes the very protein it is displaying.
This technique is used to create large peptide or protein libraries and screen them against a specific target molecule (e.g., a receptor or antibody). This process, called
biopanning
, involves selecting and enriching for the phages that bind to the target. Its main applications include antibody engineering, drug discovery, and studying protein-protein interactions.
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