The IGNOU BBCCT-125 Solved Question Paper PDF Download page is designed to help students access high-quality exam resources in one place. Here, you can find ignou solved question paper IGNOU Previous Year Question paper solved PDF that covers all important questions with detailed answers. This page provides IGNOU all Previous year Question Papers in one PDF format, making it easier for students to prepare effectively.
- IGNOU BBCCT-125 Solved Question Paper in Hindi
- IGNOU BBCCT-125 Solved Question Paper in English
- IGNOU Previous Year Solved Question Papers (All Courses)
Whether you are looking for IGNOU Previous Year Question paper solved in English or ignou previous year question paper solved in hindi, this page offers both options to suit your learning needs. These solved papers help you understand exam patterns, improve answer writing skills, and boost confidence for upcoming exams.
IGNOU BBCCT-125 Solved Question Paper PDF
This section provides IGNOU BBCCT-125 Solved Question Paper PDF in both Hindi and English. These ignou solved question paper IGNOU Previous Year Question paper solved PDF include detailed answers to help you understand exam patterns and improve your preparation. You can also access IGNOU all Previous year Question Papers in one PDF for quick and effective revision before exams.
IGNOU BBCCT-125 Previous Year Solved Question Paper in Hindi
Q1. DNA अणुओं में हेर-फेर करने के लिये उपयोग किये जाने वाले विभिन्न एन्जाइमों का वर्णन कीजिए।
Ans. आनुवंशिक अभियांत्रिकी में DNA अणुओं में हेर-फेर करने के लिए विभिन्न प्रकार के एंजाइमों का उपयोग किया जाता है, जिन्हें सामूहिक रूप से आणविक कैंची (molecular scissors), गोंद (glues) और संशोधक (modifiers) कहा जा सकता है। ये एंजाइम DNA को काटने, जोड़ने, संशोधित करने और संश्लेषित करने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। मुख्य एंजाइम इस प्रकार हैं:
1. न्यूक्लिएज (Nucleases): ये एंजाइम न्यूक्लिक एसिड में फॉस्फोडाइस्टर बंधों को तोड़ते हैं।
- प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएज (Restriction Endonucleases): ये एंजाइम DNA को विशिष्ट पहचान अनुक्रमों पर काटते हैं। ये आनुवंशिक अभियांत्रिकी की नींव हैं। टाइप II प्रतिबंधन एंजाइम सबसे अधिक उपयोग किए जाते हैं क्योंकि वे अपनी पहचान स्थल के भीतर ही काटते हैं (जैसे, Eco RI, Hind III)। वे या तो संलागी सिरे (sticky ends) या सपाट सिरे (blunt ends) बनाते हैं।
- एक्सोन्यूक्लिएज (Exonucleases): ये DNA या RNA के सिरों से न्यूक्लियोटाइड को हटाते हैं।
2. DNA लाइगेज (DNA Ligase): इस एंजाइम को “आणविक गोंद” कहा जाता है। यह DNA के दो टुकड़ों के बीच फॉस्फोडाइस्टर बंध बनाकर उन्हें जोड़ता है। यह पूरक संलागी सिरों या सपाट सिरों को जोड़ने के लिए आवश्यक है। T4 DNA लाइगेज सबसे अधिक इस्तेमाल किया जाने वाला लाइगेज है, जो ATP को ऊर्जा स्रोत के रूप में उपयोग करता है।
3. पोलीमरेज (Polymerases): ये एंजाइम एक मौजूदा टेम्पलेट के आधार पर DNA या RNA की नई किस्में संश्लेषित करते हैं।
- DNA पोलीमरेज I: यह DNA की प्रतिकृति और मरम्मत में शामिल है। इसका उपयोग अक्सर DNA खंडों में अंतराल को भरने के लिए किया जाता है।
- टैक पोलीमरेज (Taq Polymerase): यह एक ताप-स्थिर DNA पोलीमरेज है जिसे थर्मस एक्वाटिकस बैक्टीरिया से अलग किया गया है। यह पोलीमरेज चेन रिएक्शन (PCR) में उच्च तापमान पर DNA को बढ़ाने के लिए आवश्यक है।
- रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज (Reverse Transcriptase): यह एक RNA-निर्भर DNA पोलीमरेज है। यह RNA टेम्पलेट से एक पूरक DNA (cDNA) स्ट्रैंड को संश्लेषित करता है। यह cDNA लाइब्रेरी बनाने के लिए महत्वपूर्ण है।
4. संशोधित करने वाले एंजाइम (Modifying Enzymes): ये एंजाइम DNA अणुओं की संरचना को संशोधित करते हैं।
- एल्कलाइन फॉस्फेटेज (Alkaline Phosphatase): यह एंजाइम DNA के 5′ सिरे से फॉस्फेट समूह को हटाता है। इसका उपयोग वेक्टर के स्व-बंधन (self-ligation) को रोकने के लिए किया जाता है।
- पोलीन्यूक्लियोटाइड काइनेज (Polynucleotide Kinase): यह एंजाइम ATP से 5′-OH सिरे पर एक फॉस्फेट समूह को स्थानांतरित करता है। इसका उपयोग DNA को लेबल करने या लाइगेशन के लिए सिरों को तैयार करने के लिए किया जाता है।
- टर्मिनल डीऑक्सीन्यूक्लियोटिडिल ट्रांसफरेज (Terminal Deoxynucleotidyl Transferase): यह एंजाइम टेम्पलेट-स्वतंत्र तरीके से DNA के 3′ सिरों पर न्यूक्लियोटाइड जोड़ता है।
Q2. संलागी-सिरा बंधन की DNA लाइगेज द्वारा क्रिया की क्रियाविधि की व्याख्या कीजिए।
Ans. DNA लाइगेज एक महत्वपूर्ण एंजाइम है जो DNA के टुकड़ों को एक साथ जोड़कर फॉस्फोडाइस्टर बंध का निर्माण करता है। संलागी-सिरा (sticky-end) बंधन एक कुशल प्रक्रिया है क्योंकि इसमें पूरक एकल-स्ट्रैंड ओवरहैंग्स के बीच अस्थायी हाइड्रोजन बॉन्डिंग शामिल होती है, जो लाइगेशन प्रक्रिया को सुविधाजनक बनाती है।
संलागी-सिरा बंधन की क्रियाविधि में निम्नलिखित चरण शामिल हैं:
चरण 1: संलागी सिरों का निर्माण और एनीलिंग (Annealing)
सबसे पहले, वेक्टर DNA और निवेषित DNA (insert DNA) दोनों को एक ही प्रतिबंधन एंजाइम (जैसे, Eco RI) से काटा जाता है। यह एंजाइम दोनों DNA अणुओं पर समान, पूरक संलागी सिरे (cohesive or sticky ends) बनाता है। जब इन दोनों DNA को एक साथ मिलाया जाता है, तो उनके पूरक संलागी सिरे एक-दूसरे के साथ हाइड्रोजन बंध के माध्यम से जुड़ जाते हैं। यह जुड़ाव अस्थायी और कमजोर होता है, और DNA बैकबोन में अभी भी एक ‘निक’ (nick) या दरार होती है।
चरण 2: DNA लाइगेज द्वारा निक सीलिंग (Nick Sealing)
DNA लाइगेज इस निक को सील करने और एक स्थायी सहसंयोजक बंधन बनाने का कार्य करता है। T4 DNA लाइगेज, जो सबसे आम है, ATP को सह-कारक के रूप में उपयोग करता है। यह प्रक्रिया तीन उप-चरणों में होती है:
- एंजाइम का एडेनिलशन (Adenylation of the Enzyme): DNA लाइगेज एंजाइम ATP के साथ प्रतिक्रिया करता है। ATP का AMP (एडेनोसिन मोनोफॉस्फेट) हिस्सा एंजाइम पर एक लाइसिन अवशेष से सहसंयोजक रूप से जुड़ जाता है, और पाइरोफॉस्फेट (PPi) मुक्त हो जाता है। इससे एक लाइगेज-AMP मध्यवर्ती बनता है। लाइगेज + ATP → लाइगेज-AMP + PPi
- AMP का DNA पर स्थानांतरण (Transfer of AMP to DNA): लाइगेज-AMP कॉम्प्लेक्स DNA में निक की पहचान करता है। इसके बाद AMP समूह को निक के 5′-फॉस्फेट सिरे पर स्थानांतरित कर दिया जाता है। इससे DNA का 5′ सिरा सक्रिय हो जाता है। लाइगेज-AMP + 5′-PO₄-DNA → AMP-5′-PO₄-DNA + लाइगेज
- फॉस्फोडाइस्टर बंध का निर्माण (Formation of Phosphodiester Bond): अंत में, निक के 3′-हाइड्रॉक्सिल (OH) सिरे का न्यूक्लियोफिलिक आक्रमण सक्रिय 5′ सिरे पर होता है। यह 3′-OH और 5′-फॉस्फेट के बीच एक फॉस्फोडाइस्टर बंध बनाता है, जिससे निक सील हो जाता है और AMP मुक्त हो जाता है। 3′-OH-DNA + AMP-5′-PO₄-DNA → 3′-5′ फॉस्फोडाइस्टर बंध + AMP
इस प्रक्रिया के पूरा होने पर, वेक्टर और निवेषित DNA एक स्थिर और सहसंयोजक रूप से जुड़े हुए पुनर्योगज DNA (recombinant DNA) अणु का निर्माण करते हैं।
Q3. उच्चतर पादपों में उपयोग होने वाले किन्हीं दो क्लोनिंग वेक्टरों का वर्णन कीजिए।
Ans. उच्चतर पादपों में जीन स्थानांतरण के लिए कई क्लोनिंग वेक्टरों का उपयोग किया जाता है। इनमें से दो प्रमुख वेक्टर निम्नलिखित हैं:
1. टीआई प्लाज्मिड (Ti Plasmid)
टीआई (ट्यूमर-इंड्यूसिंग) प्लाज्मिड मिट्टी के जीवाणु एग्रोबैक्टीरियम ट्यूमेफेशियंस (Agrobacterium tumefaciens) में पाया जाता है। यह प्रकृति में पौधों में क्राउन गॉल रोग (crown gall disease) उत्पन्न करता है। आनुवंशिक अभियंताओं ने इस प्लाज्मिड को पौधों के लिए एक कुशल जीन स्थानांतरण वेक्टर के रूप में संशोधित किया है।
- संरचना और कार्यप्रणाली: प्राकृतिक टीआई प्लाज्मिड में एक T-DNA (ट्रांसफर DNA) क्षेत्र होता है, जो जीवाणु से पौधे की कोशिका में स्थानांतरित होकर उसके जीनोम में एकीकृत हो जाता है। T-DNA में ऑन्कोजीन (auxin और cytokinin संश्लेषण के लिए) होते हैं, जो ट्यूमर का कारण बनते हैं।
- संशोधित वेक्टर: वेक्टर के रूप में उपयोग करने के लिए, T-DNA के ट्यूमर पैदा करने वाले जीनों को हटा दिया जाता है और उनकी जगह वांछित जीन (gene of interest) और एक चयन योग्य मार्कर जीन (selectable marker gene, जैसे एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन) डाल दिया जाता है। इस “निरस्त्र” (disarmed) टीआई प्लाज्मिड का उपयोग जीन स्थानांतरण के लिए किया जाता है।
- बाइनरी वेक्टर प्रणाली: आधुनिक दृष्टिकोण में, एक बाइनरी वेक्टर प्रणाली का उपयोग किया जाता है। इसमें दो प्लाज्मिड होते हैं: (i) एक छोटा बाइनरी वेक्टर जिसमें संशोधित T-DNA (वांछित जीन के साथ) होता है, और (ii) एक हेल्पर टीआई प्लाज्मिड जिसमें T-DNA क्षेत्र नहीं होता लेकिन vir (विरुलेंस) जीन होते हैं, जो T-DNA के स्थानांतरण और एकीकरण के लिए आवश्यक प्रोटीन बनाते हैं। यह प्रणाली अधिक कुशल और संभालने में आसान है।
2. कॉलीफ्लॉवर मोजेक वायरस (CaMV) वेक्टर
कॉलीफ्लॉवर मोजेक वायरस (CaMV) एक पादप पैरा-रेट्रोवायरस है जिसमें गोलाकार, डबल-स्ट्रैंडेड DNA जीनोम होता है। इसे भी पौधों के लिए एक संभावित वेक्टर के रूप में उपयोग किया गया है।
- विशेषताएं: CaMV का सबसे महत्वपूर्ण योगदान इसका 35S प्रमोटर है। यह एक बहुत शक्तिशाली, संघटनकारी (constitutive) प्रमोटर है, जिसका अर्थ है कि यह पौधे के लगभग सभी ऊतकों में और हर समय जीन को उच्च स्तर पर अभिव्यक्त करता है। CaMV 35S प्रमोटर आज पादप जैव प्रौद्योगिकी में सबसे व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले प्रमोटरों में से एक है।
- वेक्टर के रूप में उपयोग: एक संपूर्ण वायरस वेक्टर के रूप में CaMV का उपयोग सीमित है क्योंकि इसका जीनोम छोटा है (लगभग 8 kb), जिससे बड़े DNA खंडों को डालना मुश्किल होता है। इसके अलावा, इसकी मेजबान सीमा भी संकीर्ण है।
- अनुप्रयोग: हालांकि एक संपूर्ण वेक्टर के रूप में इसका उपयोग दुर्लभ है, लेकिन इसके आनुवंशिक तत्व, विशेष रूप से CaMV 35S प्रमोटर और 35S टर्मिनेटर , अन्य वैक्टरों (जैसे टीआई प्लाज्मिड-आधारित वैक्टर) में ट्रांसजीन की उच्च-स्तरीय अभिव्यक्ति को चलाने के लिए अनिवार्य रूप से उपयोग किए जाते हैं।
Q4. निम्नलिखित में से किन्हीं दो पर संक्षिप्त टिप्पणियाँ लिखिए : (क) pBR322, (ख) सक्षम कोशिकाओं की निर्मिति, (ग) लयजनक चक्र
Ans.
(क) pBR322
pBR322 ई. कोलाई (E. coli) के लिए सबसे पहले विकसित और व्यापक रूप से उपयोग किए जाने वाले कृत्रिम क्लोनिंग प्लाज्मिड में से एक है। इसका नाम इसके रचनाकारों, बोलिवर (Bolivar) और रोड्रिगेज (Rodriguez) के नाम पर रखा गया है। यह लगभग 4,361 बेस पेयर (bp) लंबा है। pBR322 की सफलता इसके सु-परिभाषित आनुवंशिक मानचित्र और उपयोगी विशेषताओं के कारण थी, जिसने इसे आणविक क्लोनिंग में एक मानक बना दिया।
इसकी मुख्य विशेषताएं हैं:
- प्रतिकृति का मूल (Origin of Replication – ori): इसमें एक ori साइट होती है जो ई. कोलाई में प्लाज्मिड की प्रतिकृति को नियंत्रित करती है, जिससे प्रति कोशिका लगभग 15-20 प्रतियां बनती हैं।
- चयन योग्य मार्कर (Selectable Markers): pBR322 में दो एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन होते हैं – एक एम्पीसिलीन प्रतिरोध ( amp R ) के लिए और दूसरा टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध ( tet R ) के लिए। ये जीन रूपांतरित कोशिकाओं को गैर-रूपांतरित कोशिकाओं से अलग करने में मदद करते हैं।
- अद्वितीय प्रतिबंधन स्थल (Unique Restriction Sites): इसमें कई अद्वितीय प्रतिबंधन एंजाइम स्थल होते हैं जो क्लोनिंग के लिए उपयोगी होते हैं। महत्वपूर्ण बात यह है कि कई स्थल (जैसे Bam HI, Sal I) tet R जीन के भीतर और अन्य (जैसे Pst I) amp R जीन के भीतर स्थित हैं। यह निवेशी निष्क्रियता (insertional inactivation) द्वारा पुनर्योगज प्लाज्मिड की पहचान करने की अनुमति देता है। उदाहरण के लिए, यदि Bam HI स्थल पर एक विदेशी DNA डाला जाता है, तो tet R जीन निष्क्रिय हो जाता है, और कोशिका टेट्रासाइक्लिन के प्रति संवेदनशील हो जाती है लेकिन एम्पीसिलीन के प्रति प्रतिरोधी बनी रहती है।
(ख) सक्षम कोशिकाओं की निर्मिति (Preparation of competent cells)
सक्षमता (Competence) एक कोशिका की वह शारीरिक अवस्था है जिसमें वह अपने पर्यावरण से विदेशी DNA (जैसे प्लाज्मिड) को ग्रहण करने में सक्षम हो जाती है। इस प्रक्रिया को रूपांतरण (transformation) कहते हैं। बैक्टीरिया, जैसे ई. कोलाई , स्वाभाविक रूप से बहुत सक्षम नहीं होते हैं, इसलिए उन्हें प्रयोगशाला में कृत्रिम रूप से सक्षम बनाया जाता है। सक्षम कोशिकाएं तैयार करने की दो मुख्य विधियां हैं:
1. रासायनिक सक्षमता (Chemical Competence): यह सबसे आम तरीका है।
- इसमें बैक्टीरिया कोशिकाओं को बर्फ पर ठंडे कैल्शियम क्लोराइड (CaCl₂) के घोल में रखा जाता है।
- Ca²⁺ आयन कोशिका झिल्ली और DNA दोनों पर मौजूद ऋणात्मक आवेशों को उदासीन करने में मदद करते हैं, जिससे DNA कोशिका की सतह के करीब आ सकता है।
- इसके बाद, कोशिकाओं को एक संक्षिप्त हीट शॉक (heat shock) दिया जाता है (आमतौर पर 42°C पर 45-90 सेकंड के लिए)। यह हीट शॉक कोशिका झिल्ली में अस्थायी छिद्र बनाता है, जिससे प्लाज्मिड DNA कोशिका के अंदर प्रवेश कर जाता है।
- हीट शॉक के बाद, कोशिकाओं को तुरंत बर्फ पर वापस रख दिया जाता है और फिर उन्हें पोषक माध्यम में वृद्धि के लिए रखा जाता है।
2. इलेक्ट्रोपोरेशन (Electroporation): यह एक अधिक कुशल लेकिन महंगी विधि है।
- इसमें कोशिकाओं और DNA के मिश्रण को एक उच्च-वोल्टेज विद्युत पल्स के संपर्क में लाया जाता है।
- विद्युत पल्स कोशिका झिल्ली में अस्थायी छिद्र (इलेक्ट्रोपोर्स) बना देता है, जिससे DNA सीधे कोशिका में प्रवेश कर जाता है।
दोनों विधियों का उद्देश्य कोशिका झिल्ली को विदेशी DNA के लिए अस्थायी रूप से पारगम्य बनाना है।
Q5. रूपांतरित कोशिकाओं की पहचान के लिये उपयोग की जाने वाली किन्हीं दो चयन सम्बन्धी विधियों के सिद्धान्त की व्याख्या कीजिए।
Ans. रूपांतरण (Transformation) प्रक्रिया के बाद, केवल कुछ ही कोशिकाएं विदेशी DNA को सफलतापूर्वक ग्रहण करती हैं। इन रूपांतरित कोशिकाओं को गैर-रूपांतरित कोशिकाओं की विशाल आबादी से पहचानना और अलग करना आवश्यक होता है। इसके लिए कई चयन विधियों का उपयोग किया जाता है। दो प्रमुख विधियों के सिद्धांत इस प्रकार हैं:
1. एंटीबायोटिक प्रतिरोध द्वारा चयन (Selection by Antibiotic Resistance)
- सिद्धांत: इस विधि का सिद्धांत यह है कि क्लोनिंग वेक्टर (प्लाज्मिड) में एक चयन योग्य मार्कर जीन होता है जो एक विशिष्ट एंटीबायोटिक के प्रति प्रतिरोध प्रदान करता है। उदाहरण के लिए, amp R जीन एम्पीसिलीन के प्रति प्रतिरोध प्रदान करता है।
- प्रक्रिया: रूपांतरण के बाद, जीवाणु कोशिकाओं के मिश्रण (रूपांतरित और गैर-रूपांतरित) को एक पोषक माध्यम युक्त अगर प्लेट पर फैलाया जाता है जिसमें वह विशिष्ट एंटीबायोटिक (जैसे, एम्पीसिलीन) मिला होता है।
- परिणाम:
- जिन कोशिकाओं ने प्लाज्मिड को सफलतापूर्वक ग्रहण कर लिया है ( रूपांतरित कोशिकाएं ), वे एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन को अभिव्यक्त करती हैं। परिणामस्वरूप, वे एंटीबायोटिक की उपस्थिति में जीवित रह सकती हैं और कॉलोनी बना सकती हैं।
- जिन कोशिकाओं ने प्लाज्मिड ग्रहण नहीं किया है ( गैर-रूपांतरित कोशिकाएं ), वे एंटीबायोटिक के प्रति संवेदनशील होती हैं और मर जाती हैं।
- सीमा: यह विधि केवल रूपांतरित कोशिकाओं का चयन करती है, लेकिन यह नहीं बताती कि प्लाज्मिड पुनर्योगज (recombinant) है या नहीं (यानी, उसमें निवेषित DNA है या नहीं)।
2. नीली-सफेद स्क्रीनिंग (Blue-White Screening) या अल्फा-पूरकता (α-complementation)
- सिद्धांत: यह विधि पुनर्योगज प्लाज्मिड वाली कोशिकाओं को गैर-पुनर्योगज प्लाज्मिड वाली कोशिकाओं से अलग करने के लिए उपयोग की जाती है। यह lacZ जीन की निवेशी निष्क्रियता (insertional inactivation) के सिद्धांत पर आधारित है।
- आवश्यकताएँ:
- एक विशेष वेक्टर जिसमें lacZα जीन और इसके भीतर एक मल्टीपल क्लोनिंग साइट (MCS) हो।
- एक मेजबान ई. कोलाई स्ट्रेन जिसमें lacZ जीन का एक निष्क्रिय रूप हो।
- एक क्रोमोजेनिक सबस्ट्रेट (जैसे X-gal) और एक इंड्यूसर (IPTG) युक्त माध्यम।
- प्रक्रिया और परिणाम:
- गैर-पुनर्योगज (नीली कॉलोनियां): यदि कोई विदेशी DNA MCS में नहीं डाला जाता है, तो lacZα जीन अखंड रहता है। यह मेजबान के निष्क्रिय lacZ प्रोटीन के साथ मिलकर एक कार्यात्मक β-गैलेक्टोसिडेज एंजाइम बनाता है (α-पूरकता)। यह एंजाइम X-gal को तोड़ता है, जिससे एक नीला रंग का उत्पाद बनता है और कॉलोनियां नीली दिखाई देती हैं।
- पुनर्योगज (सफेद कॉलोनियां): यदि विदेशी DNA को सफलतापूर्वक MCS में डाला जाता है, तो lacZα जीन बाधित और निष्क्रिय हो जाता है। कोई कार्यात्मक β-गैलेक्टोसिडेज एंजाइम नहीं बनता है। X-gal नहीं टूटता है, और कॉलोनियां सफेद रहती हैं।
- निष्कर्ष: इस प्रकार, सफेद कॉलोनियां उन कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं जिनमें वांछित निवेषित DNA के साथ पुनर्योगज प्लाज्मिड होता है, जबकि नीली कॉलोनियां उन कोशिकाओं का प्रतिनिधित्व करती हैं जिनमें केवल वेक्टर होता है।
Q6. जीनोमिक लाइब्रेरी के लाभों, नुकसान और अनुप्रयोगों का उल्लेख कीजिए।
Ans. एक जीनोमिक लाइब्रेरी एक जीव के संपूर्ण जीनोम का प्रतिनिधित्व करने वाले DNA खंडों का एक संग्रह है। इन खंडों को क्लोनिंग वेक्टरों में डाला जाता है और मेजबान जीवों (जैसे ई. कोलाई ) की आबादी में संग्रहीत किया जाता है।
लाभ (Advantages)
- संपूर्ण जीनोम का प्रतिनिधित्व: जीनोमिक लाइब्रेरी में एक जीव का पूरा आनुवंशिक पदार्थ होता है, जिसमें कोडिंग (एक्सॉन), नॉन-कोडिंग (इंट्रॉन), नियामक अनुक्रम (प्रमोटर, एनहांसर) और अन्य सभी DNA अनुक्रम शामिल होते हैं।
- स्रोत की स्वतंत्रता: इसे किसी भी ऊतक से बनाया जा सकता है, क्योंकि एक जीव की प्रत्येक कोशिका में समान जीनोम होता है। यह जीन अभिव्यक्ति के स्तर पर निर्भर नहीं करता है।
- नियामक अनुक्रमों का अध्ययन: यह जीन के नियामक तत्वों जैसे प्रमोटर और एनहांसर के अध्ययन के लिए अमूल्य है, जो जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करते हैं।
- जीनोम अनुक्रमण: यह संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण परियोजनाओं के लिए प्रारंभिक सामग्री प्रदान करता है।
नुकसान (Disadvantages)
- बड़ा आकार और जटिलता: यूकेरियोटिक जीनोम बहुत बड़े होते हैं और उनमें बड़ी मात्रा में नॉन-कोडिंग DNA होता है। इसके कारण लाइब्रेरी बहुत बड़ी और छानने (screen) में मुश्किल हो जाती है।
- इंट्रॉन की उपस्थिति: यूकेरियोटिक जीनों में इंट्रॉन होते हैं। यदि जीनोमिक लाइब्रेरी से प्राप्त किसी जीन को प्रोकैरियोटिक सिस्टम (जैसे ई. कोलाई ) में अभिव्यक्त करने का प्रयास किया जाता है, तो यह काम नहीं करेगा क्योंकि प्रोकैरियोट्स में इंट्रॉन को हटाने के लिए स्प्लिसिंग मशीनरी नहीं होती है।
- जीन की पहचान में कठिनाई: विशाल लाइब्रेरी में से किसी एक विशिष्ट जीन को खोजना बहुत समय लेने वाला और श्रमसाध्य हो सकता है, जिसे “भूसे के ढेर में सुई खोजना” जैसा कहा जा सकता है।
अनुप्रयोग (Applications)
- जीन की खोज और क्लोनिंग: किसी जीव से विशिष्ट जीन (ज्ञात या अज्ञात) को अलग करने और उसकी विशेषताएँ जानने के लिए।
- जीनोम मैपिंग और अनुक्रमण: संपूर्ण जीनोम का भौतिक मानचित्र बनाने और उसके अनुक्रम का निर्धारण करने के लिए (जैसे मानव जीनोम परियोजना)।
- जीन विनियमन का अध्ययन: जीन अभिव्यक्ति को नियंत्रित करने वाले प्रमोटर, एनहांसर और अन्य नियामक तत्वों की पहचान और विश्लेषण के लिए।
- आनुवंशिक रोगों का अध्ययन: वंशानुगत रोगों से जुड़े जीन या उत्परिवर्तन की पहचान करने के लिए।
- तुलनात्मक जीनोमिक्स: विभिन्न प्रजातियों के जीनोम की संरचना और संगठन की तुलना करके विकासवादी संबंधों का अध्ययन करने के लिए।
Q7. निम्नलिखित में अंतर कीजिए : (क) रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पी.सी.आर. (आर.टी.-पी.सी.आर.) तथा वास्तविक समय पी.सी.आर. (क्यू-पी.सी.आर.), (ख) जीन कैसेट तथा फ्यूजन जीन
Ans.
(क) रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पी.सी.आर. (RT-PCR) और वास्तविक समय पी.सी.आर. (qPCR) में अंतर
विशेषता
रिवर्स ट्रांसक्रिप्शन पी.सी.आर. (RT-PCR)
वास्तविक समय पी.सी.आर. (qPCR)
मुख्य उद्देश्य
RNA अणुओं का पता लगाना और उन्हें बढ़ाना (amplify करना)। यह RNA को DNA में परिवर्तित करके काम करता है।
PCR प्रवर्धन के दौरान DNA की मात्रा को वास्तविक समय में मापना (quantify करना)।
प्रारंभिक टेम्पलेट
RNA (जैसे mRNA)।
DNA या cDNA (जो RNA से बना हो सकता है)।
प्रमुख एंजाइम
पहले चरण में रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज , उसके बाद DNA पोलीमरेज (जैसे Taq)।
DNA पोलीमरेज । यदि RNA से शुरू कर रहे हैं (RT-qPCR), तो रिवर्स ट्रांसक्रिप्टेज का भी उपयोग होता है।
पता लगाना (Detection)
प्रतिक्रिया के अंत में (end-point)। प्रवर्धित उत्पादों को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस द्वारा देखा जाता है।
प्रतिक्रिया के दौरान वास्तविक समय में (real-time)। प्रतिदीप्ति (fluorescence) का उपयोग करके प्रवर्धन को मापा जाता है।
परिमाणीकरण (Quantification)
गुणात्मक (हाँ/नहीं) या अर्ध-मात्रात्मक। सटीक मात्रा का पता लगाना मुश्किल है।
अत्यधिक मात्रात्मक। यह प्रारंभिक टेम्पलेट की सटीक मात्रा बता सकता है।
अनुप्रयोग
जीन अभिव्यक्ति का पता लगाना, RNA वायरस का निदान (जैसे HIV, SARS-CoV-2), cDNA क्लोनिंग।
जीन अभिव्यक्ति का सटीक मापन, वायरल लोड का निर्धारण, GMO का पता लगाना।
(ख) जीन कैसेट (Gene Cassettes) और फ्यूजन जीन (Fusion Genes) में अंतर
विशेषता
जीन कैसेट
फ्यूजन जीन
परिभाषा
एक गतिशील आनुवंशिक तत्व जिसमें एक या अधिक जीन और एक विशिष्ट पुनर्संयोजन स्थल (recombination site, attC ) होता है।
एक हाइब्रिड जीन जो दो या दो से अधिक अलग-अलग जीनों के भागों को जोड़कर बनाया जाता है।
मुख्य कार्य
जीनों को एक आनुवंशिक स्थान से दूसरे स्थान पर आसानी से स्थानांतरित करना (shuffling)। यह एक मॉड्यूलर इकाई के रूप में कार्य करता है।
एक एकल फ्यूजन प्रोटीन का उत्पादन करना जिसमें दोनों मूल प्रोटीनों के गुण या कार्य शामिल हों।
अभिव्यक्ति
आमतौर पर इनके पास अपना प्रमोटर नहीं होता है और ये अभिव्यक्ति के लिए इंटीग्रॉन (integron) जैसे बड़े ढांचे में मौजूद प्रमोटर पर निर्भर करते हैं।
एक एकल प्रमोटर के नियंत्रण में एक एकल ओपन रीडिंग फ्रेम (ORF) के रूप में अभिव्यक्त होता है।
संरचना
संरचना: [पुनर्संयोजन स्थल] – [जीन] – [पुनर्संयोजन स्थल]। ये इंटीग्रॉन द्वारा ग्रहण और व्यक्त किए जा सकते हैं।
संरचना: [जीन A का भाग] – [जीन B का भाग]। परिणामी प्रोटीन एक एकल पॉलीपेप्टाइड श्रृंखला होती है।
उदाहरण
एंटीबायोटिक प्रतिरोध कैसेट (जैसे, cat , aadA ) जो बैक्टीरिया में प्रतिरोध फैलाते हैं। आणविक क्लोनिंग में मार्कर जीन के रूप में उपयोग।
GFP फ्यूजन जीन: एक लक्ष्य प्रोटीन को उसकी कोशिका में स्थिति देखने के लिए GFP (ग्रीन फ्लोरोसेंट प्रोटीन) के साथ जोड़ा जाता है। GST-टैग फ्यूजन: प्रोटीन शुद्धिकरण को आसान बनाने के लिए।
Q8. (क) पायरोसीक्वेसिंग क्या होती है? (ख) स्थल-निर्देशित उत्परिवर्तन के कृषि तथा फसल सुधार के अनुप्रयोगों को सूचीबद्ध कीजिए।
Ans.
(क) पायरोसीक्वेसिंग (Pyrosequencing)
पायरोसीक्वेसिंग एक “संश्लेषण द्वारा अनुक्रमण” (sequencing-by-synthesis) विधि है, जो अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (Next-Generation Sequencing, NGS) तकनीकों में से एक है। इसका सिद्धांत DNA पोलीमरेज द्वारा एक नए न्यूक्लियोटाइड को बढ़ते DNA स्ट्रैंड में शामिल करने पर जारी होने वाले पाइरोफॉस्फेट (PPi) का पता लगाने पर आधारित है।
इस प्रक्रिया में निम्नलिखित चरण होते हैं:
- एक एकल-स्ट्रैंडेड DNA टेम्पलेट को एक अनुक्रमण प्राइमर के साथ एनील किया जाता है।
- एक समय में केवल एक प्रकार का डीऑक्सीन्यूक्लियोटाइड ट्राईफॉस्फेट (dNTP), जैसे dATP, को मिश्रण में जोड़ा जाता है।
- यदि यह dNTP टेम्पलेट के अगले बेस के पूरक है, तो DNA पोलीमरेज इसे शामिल कर लेता है। इस प्रक्रिया में, एक पाइरोफॉस्फेट (PPi) अणु मुक्त होता है।
- एक अन्य एंजाइम, ATP सल्फ्यूरिलस , इस PPi को एडेनोसिन 5′ फॉस्फोसल्फेट (APS) की उपस्थिति में ATP में परिवर्तित कर देता है।
- उत्पन्न ATP का उपयोग ल्यूसिफरेज एंजाइम द्वारा ल्यूसिफेरिन को ऑक्सील्यूसिफेरिन में बदलने के लिए किया जाता है, जिससे प्रकाश का एक फ्लैश उत्पन्न होता है।
- इस प्रकाश को एक कैमरे द्वारा पता लगाया जाता है और एक पायरोग्राम पर एक शिखर (peak) के रूप में दर्ज किया जाता है। शिखर की ऊंचाई शामिल किए गए न्यूक्लियोटाइड की संख्या के समानुपाती होती है (जैसे, यदि दो ‘T’ एक साथ हैं, तो dATP जोड़ने पर कोई प्रकाश नहीं होगा, लेकिन dTTP जोड़ने पर दोगुनी ऊंचाई का शिखर मिलेगा)।
- बिना शामिल हुए न्यूक्लियोटाइड और ATP को एपिरेस एंजाइम द्वारा नष्ट कर दिया जाता है, जिसके बाद अगला dNTP जोड़ा जाता है।
यह चक्र दोहराया जाता है, और उत्पन्न प्रकाश संकेतों के क्रम से DNA अनुक्रम का निर्धारण किया जाता है।
(ख) कृषि तथा फसल सुधार में स्थल-निर्देशित उत्परिवर्तन के अनुप्रयोग
स्थल-निर्देशित उत्परिवर्तन (Site-Directed Mutagenesis, SDM) एक शक्तिशाली तकनीक है जो एक जीन में विशिष्ट स्थानों पर सटीक आनुवंशिक परिवर्तन करने की अनुमति देती है। कृषि में, इसका उपयोग फसल सुधार के लिए किया जाता है। इसके प्रमुख अनुप्रयोग निम्नलिखित हैं:
- शाकनाशी प्रतिरोध (Herbicide Resistance): फसलों में ऐसे एंजाइमों को संशोधित करना जो शाकनाशियों के लक्ष्य होते हैं। उदाहरण के लिए, EPSPS एंजाइम में उत्परिवर्तन करके ग्लाइफोसेट (जैसे राउंडअप) के प्रति प्रतिरोधी फसलें (जैसे सोयाबीन, मक्का) बनाना।
- बेहतर पोषण मूल्य (Improved Nutritional Value): फसलों की पोषण सामग्री को बढ़ाना। जैसे, ‘गोल्डन राइस’ में विटामिन ए के अग्रदूत, बीटा-कैरोटीन का उत्पादन बढ़ाने के लिए चयापचय मार्गों को संशोधित करना।
- कीट और रोग प्रतिरोधक क्षमता (Pest and Disease Resistance): पौधों के जीनों को इस तरह से संशोधित करना कि वे विशिष्ट कीटों या रोगजनकों के प्रति प्रतिरोधी हो जाएं, जिससे रासायनिक कीटनाशकों पर निर्भरता कम हो।
- फसल की शेल्फ-लाइफ में सुधार (Improved Shelf Life): फलों के पकने या नरम होने की प्रक्रिया को धीमा करने वाले जीनों को संशोधित करना। उदाहरण के लिए, टमाटर में पॉलीगैलेक्टुरोनेज जीन की गतिविधि को कम करना।
- अजैविक तनाव सहिष्णुता (Abiotic Stress Tolerance): सूखा, लवणता और अत्यधिक तापमान जैसे पर्यावरणीय तनावों का सामना करने में सक्षम फसलें विकसित करना। यह तनाव-प्रतिक्रिया मार्गों में शामिल जीनों को संशोधित करके किया जाता है।
- अवांछित यौगिकों को हटाना (Removal of Undesirable Compounds): खाद्य फसलों से एलर्जी पैदा करने वाले या विषैले यौगिकों को हटाने के लिए संबंधित जीनों को निष्क्रिय करना।
Q9. कृषि में आनुवंशिकी अभियंत्रिकी के अनुप्रयोगों की व्याख्या कीजिए। आनुवंशिकी रूप से संशोधित पौधों से जुड़ी हुई समस्याओं को सूचीबद्ध कीजिए।
Ans. आनुवंशिक अभियांत्रिकी ने कृषि क्षेत्र में क्रांति ला दी है, जिससे फसलों की पैदावार, पोषण और स्थिरता में सुधार हुआ है। इसे “हरित क्रांति 2.0” भी कहा जाता है।
कृषि में आनुवंशिक अभियांत्रिकी के अनुप्रयोग:
- फसल सुधार (Crop Improvement):
- कीट प्रतिरोध: बैसिलस थुरिंजिएंसिस (Bt) जीवाणु से एक जीन (क्राई जीन) को कपास, मक्का, और बैंगन जैसी फसलों में डालकर Bt फसलें बनाई गई हैं। ये फसलें एक प्रोटीन का उत्पादन करती हैं जो कुछ कीड़ों (जैसे बॉलवर्म) के लिए विषैला होता है, जिससे कीटनाशकों का उपयोग कम हो जाता है।
- शाकनाशी सहिष्णुता: फसलों को विशिष्ट शाकनाशियों (जैसे ग्लाइफोसेट) के प्रति सहनशील बनाया गया है। इससे किसान खरपतवार को नियंत्रित करने के लिए खेत में शाकनाशी का छिड़काव कर सकते हैं बिना फसल को नुकसान पहुँचाए। “राउंडअप रेडी” फसलें इसका प्रमुख उदाहरण हैं।
- रोग प्रतिरोध: पौधों को वायरस, कवक और बैक्टीरिया के प्रति प्रतिरोधी बनाने के लिए जीन डाले गए हैं, जिससे फसल का नुकसान कम होता है।
- बढ़ी हुई पोषण गुणवत्ता (Enhanced Nutrition – Biofortification):
- गोल्डन राइस: इसमें विटामिन ए के अग्रदूत, बीटा-कैरोटीन का उत्पादन करने के लिए जीन डाले गए हैं, ताकि विकासशील देशों में विटामिन ए की कमी को दूर किया जा सके।
- उच्च लाइसिन मक्का: पशु आहार के लिए प्रोटीन की गुणवत्ता में सुधार के लिए लाइसिन जैसे आवश्यक अमीनो एसिड का स्तर बढ़ाया गया है।
- अजैविक तनाव सहिष्णुता (Abiotic Stress Tolerance):
- सूखा, लवणता, और अत्यधिक तापमान जैसी कठोर पर्यावरणीय परिस्थितियों का सामना करने में सक्षम फसलें विकसित की जा रही हैं।
- कटाई के बाद के गुण (Post-Harvest Qualities):
- फलों और सब्जियों की शेल्फ-लाइफ बढ़ाने के लिए पकने की प्रक्रिया को धीमा किया गया है, जैसा कि ‘फ्लेवर सेवर’ टमाटर में किया गया था।
आनुवंशिक रूप से संशोधित (GM) पौधों से जुड़ी समस्याएं और चिंताएँ:
- पर्यावरणीय चिंताएँ:
- जीन प्रवाह (Gene Flow): GM फसलों से उनके जंगली रिश्तेदारों में परागण के माध्यम से जीनों का अनियंत्रित प्रसार हो सकता है, जिससे “सुपरवीड्स” का निर्माण हो सकता है जो शाकनाशियों के प्रतिरोधी हों।
- गैर-लक्षित जीवों पर प्रभाव: यह चिंता व्यक्त की गई है कि GM फसलों के विषाक्त पदार्थ (जैसे Bt टॉक्सिन) लाभकारी या गैर-लक्षित कीड़ों को नुकसान पहुंचा सकते हैं (जैसे, मोनार्क तितली)।
- प्रतिरोध का विकास: समय के साथ, कीट Bt टॉक्सिन के प्रति और खरपतवार शाकनाशियों के प्रति प्रतिरोध विकसित कर सकते हैं, जिससे इन तकनीकों की प्रभावशीलता कम हो जाती है।
- मानव स्वास्थ्य संबंधी चिंताएँ:
- एलर्जी की संभावना (Allergenicity): यह चिंता है कि नए प्रोटीन के परिचय से कुछ लोगों में एलर्जी की प्रतिक्रिया हो सकती है। (हालांकि, सभी GM खाद्य पदार्थ बाजार में आने से पहले कठोर एलर्जी परीक्षण से गुजरते हैं)।
- विषाक्तता (Toxicity): नए जीन उत्पादों की दीर्घकालिक सुरक्षा के बारे में चिंताएं उठाई गई हैं।
- सामाजिक-आर्थिक मुद्दे:
- कॉर्पोरेट नियंत्रण: बीज बाजार पर कुछ बहुराष्ट्रीय कंपनियों का एकाधिकार हो गया है, जिससे किसानों की पसंद सीमित हो जाती है।
- बौद्धिक संपदा अधिकार: पेटेंट किए गए बीजों के कारण किसान पारंपरिक रूप से अपनी फसल से बीज नहीं बचा सकते हैं, जिससे उन्हें हर साल बीज खरीदना पड़ता है।
- उपभोक्ता स्वीकृति और लेबलिंग: GM खाद्य पदार्थों की लेबलिंग को लेकर दुनिया भर में बहस जारी है, जो उपभोक्ता की पसंद और विश्वास से जुड़ा मुद्दा है।
Q10. निम्नलिखित में से किन्हीं दो पर संक्षिप्त टिप्पणियाँ लिखिए : (क) सोमैटिक सेल जीन थैरेपी, (ख) डायलिसिस, (ग) इम्युनोएफिनिटी क्रोमैटोग्राफी
Ans.
(क) सोमैटिक सेल जीन थैरेपी (Somatic Cell Gene Therapy)
सोमैटिक सेल जीन थेरेपी एक चिकित्सीय तकनीक है जिसमें किसी व्यक्ति की दैहिक कोशिकाओं (somatic cells), यानी गैर-प्रजनन कोशिकाओं (जैसे रक्त कोशिकाएं, त्वचा कोशिकाएं) में एक कार्यात्मक जीन को प्रवेश कराकर आनुवंशिक रोगों का इलाज किया जाता है।
इसकी मुख्य विशेषताएं हैं:
- गैर-आनुवंशिक (Non-heritable): चूंकि यह केवल दैहिक कोशिकाओं को संशोधित करता है, इसलिए किए गए आनुवंशिक परिवर्तन अगली पीढ़ी में स्थानांतरित नहीं होते हैं। यह परिवर्तन केवल उस व्यक्ति तक ही सीमित रहता है जिसका इलाज किया जा रहा है।
- उद्देश्य: इसका मुख्य उद्देश्य दोषपूर्ण जीन के कार्य को ठीक करना, बदलना या पूरक करना है। उदाहरण के लिए, एक लापता या गैर-कार्यात्मक प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए एक सही जीन की प्रतिलिपि प्रदान करना।
- विधियाँ:
- एक्स वीवो ( Ex vivo ): इसमें रोगी के शरीर से कोशिकाओं (जैसे अस्थि मज्जा कोशिकाओं) को निकाला जाता है, उन्हें प्रयोगशाला में आनुवंशिक रूप से संशोधित किया जाता है, और फिर वापस रोगी में डाल दिया जाता है। यह अधिक सुरक्षित और नियंत्रित तरीका है।
- इन वीवो ( In vivo ): इसमें चिकित्सीय जीन को एक वेक्टर (आमतौर पर एक संशोधित वायरस) में पैक करके सीधे रोगी के शरीर में (जैसे इंजेक्शन द्वारा) पहुंचाया जाता है।
- उदाहरण: गंभीर संयुक्त इम्यूनोडेफिशिएंसी (SCID) का उपचार, जिसमें एडेनोसिन डिएमिनेज (ADA) जीन की एक कार्यात्मक प्रतिलिपि रोगी की हेमटोपोइएटिक स्टेम कोशिकाओं में डाली जाती है।
(ग) इम्युनोएफिनिटी क्रोमैटोग्राफी (Immunoaffinity Chromatography)
इम्युनोएफिनिटी क्रोमैटोग्राफी एक अत्यधिक विशिष्ट प्रकार की एफिनिटी क्रोमैटोग्राफी है जो एक जटिल मिश्रण से एक विशिष्ट अणु (आमतौर पर एक प्रोटीन) को शुद्ध करने के लिए एंटीबॉडी और उसके एंटीजन के बीच की मजबूत और विशिष्ट बंधन क्षमता का उपयोग करती है।
प्रक्रिया के मुख्य चरण इस प्रकार हैं:
- स्थिर चरण (Stationary Phase): एक विशिष्ट एंटीबॉडी (या एंटीजन) को एक अक्रिय मैट्रिक्स (जैसे एगरोज बीड्स) से सहसंयोजक रूप से जोड़ा जाता है और एक कॉलम में पैक किया जाता है। इस मैट्रिक्स को “इम्युनोसॉर्बेंट” कहा जाता है।
- लोडिंग (Loading): जिस मिश्रण में लक्षित अणु (एंटीजन) होता है, उसे कॉलम से गुजारा जाता है।
- बंधन (Binding): जब मिश्रण कॉलम से गुजरता है, तो केवल लक्षित एंटीजन ही मैट्रिक्स से जुड़ी एंटीबॉडी के साथ विशिष्ट रूप से बंधता है। मिश्रण में मौजूद अन्य सभी अणु बिना बंधे कॉलम से बाहर निकल जाते हैं।
- धुलाई (Washing): कॉलम को बफर से धोया जाता है ताकि कोई भी गैर-विशिष्ट रूप से बंधा हुआ अणु हटाया जा सके।
- मोचन (Elution): बंधे हुए एंटीजन को एंटीबॉडी से अलग करने के लिए परिस्थितियों को बदला जाता है। यह आमतौर पर कम pH वाले बफर (जैसे ग्लाइसिन बफर, pH 2.5-3.0) का उपयोग करके या एक प्रतिस्पर्धी लिगैंड का उपयोग करके किया जाता है। शुद्ध किया गया एंटीजन फिर कॉलम से बाहर निकलता है और एकत्र कर लिया जाता है।
यह तकनीक एक ही चरण में बहुत उच्च शुद्धता (>95%) प्राप्त करने की क्षमता के कारण बहुत शक्तिशाली है। इसका उपयोग चिकित्सीय प्रोटीन, एंटीबॉडी और टीकों के शुद्धिकरण में व्यापक रूप से किया जाता है।
IGNOU BBCCT-125 Previous Year Solved Question Paper in English
Q1. Describe various enzymes used for manipulating DNA molecules.
Ans. The manipulation of DNA molecules in genetic engineering relies on a variety of enzymes, often referred to as the “molecular toolkit”. These enzymes are essential for cutting, joining, synthesizing, and modifying DNA. The major classes of enzymes are as follows: 1. Nucleases: These enzymes cleave the phosphodiester bonds of nucleic acids.
- Restriction Endonucleases: These are fundamental to genetic engineering. They act as “molecular scissors,” cutting DNA at specific recognition sequences. Type II restriction enzymes are most commonly used because they cleave within their recognition site (e.g., Eco RI, Hind III). They can generate either sticky (cohesive) ends or blunt ends, which is crucial for cloning.
- Exonucleases: These enzymes remove nucleotides from the ends of a DNA or RNA strand.
2. DNA Ligase:
Often called “molecular glue,” this enzyme joins two pieces of DNA by forming a
phosphodiester bond
between the 3′-OH of one nucleotide and the 5′-phosphate of another. It is essential for ligating a DNA insert into a vector. T4 DNA Ligase is the most widely used ligase and requires ATP as an energy source.
3. Polymerases:
These enzymes synthesize new strands of DNA or RNA using an existing template.
- DNA Polymerase I: Involved in DNA replication and repair. It’s often used to fill in gaps in DNA fragments.
- Taq Polymerase: A thermostable DNA polymerase isolated from the bacterium Thermus aquaticus . Its ability to withstand high temperatures makes it indispensable for the Polymerase Chain Reaction (PCR).
- Reverse Transcriptase: This is an RNA-dependent DNA polymerase. It synthesizes a complementary DNA (cDNA) strand from an RNA template. This is crucial for creating cDNA libraries and for techniques like RT-PCR.
4. Modifying Enzymes:
These enzymes modify the structure of DNA molecules.
- Alkaline Phosphatase: This enzyme removes the phosphate group from the 5′ end of a DNA molecule. It is used to prevent self-ligation of a vector during a cloning experiment.
- Polynucleotide Kinase: This enzyme adds a phosphate group from ATP to the 5′-OH end of a DNA or RNA molecule. It is used for labeling DNA and preparing ends for ligation.
- Terminal Deoxynucleotidyl Transferase: This enzyme adds nucleotides to the 3′ ends of DNA molecules in a template-independent manner. It is used for creating homopolymer tails.
Q2. Explain the mechanism of sticky-end ligation by DNA ligase.
Ans. DNA ligase is an essential enzyme that joins DNA fragments by catalysing the formation of a phosphodiester bond . Sticky-end ligation is a highly efficient process because it involves the temporary hydrogen bonding of complementary single-stranded overhangs, which facilitates the ligation reaction. The mechanism of sticky-end ligation involves the following key steps: Step 1: Generation and Annealing of Sticky Ends First, both the vector DNA and the insert DNA are cut with the same restriction enzyme (e.g., Eco RI). This creates identical, complementary cohesive or “sticky” ends on both DNA molecules. When the insert and vector DNA are mixed together, their complementary sticky ends can pair up via hydrogen bonds . This temporary association is called annealing. This pairing brings the ends that need to be joined into close proximity, but there is still a “nick” (a break) in the sugar-phosphate backbone of each strand. Step 2: Sealing the Nick by DNA Ligase DNA ligase carries out the function of sealing this nick and creating a permanent covalent bond. The most common enzyme, T4 DNA ligase, uses ATP as a cofactor. The reaction proceeds in three sub-steps:
- Adenylation of the Enzyme: The DNA ligase enzyme reacts with ATP. The AMP (adenosine monophosphate) moiety of ATP becomes covalently attached to a lysine residue on the enzyme, releasing pyrophosphate (PPi). This forms a Ligase-AMP intermediate. Ligase + ATP → Ligase-AMP + PPi
- Transfer of AMP to DNA: The Ligase-AMP complex identifies the nick in the DNA. The AMP group is then transferred from the ligase to the 5′-phosphate group at the nick. This “activates” the 5′ end of the DNA. Ligase-AMP + 5′-PO₄-DNA → AMP-5′-PO₄-DNA + Ligase
- Formation of Phosphodiester Bond: Finally, the 3′-hydroxyl (OH) group at the nick performs a nucleophilic attack on the activated 5′ phosphate. This attack forms the phosphodiester bond, sealing the nick and releasing AMP. 3′-OH-DNA + AMP-5′-PO₄-DNA → 3′-5′ phosphodiester bond + AMP
Upon completion of this process, the vector and insert DNA are stably and covalently joined, forming a single recombinant DNA molecule.
Q3. Describe any two cloning vectors used for higher plants.
Ans. Several cloning vectors are used for gene transfer in higher plants. Two of the most important and widely used vectors are described below: 1. The Ti Plasmid The Ti (Tumor-inducing) plasmid is found in the soil bacterium Agrobacterium tumefaciens . In nature, this bacterium causes crown gall disease in dicotyledonous plants by transferring a part of its Ti plasmid into the plant cell genome. Genetic engineers have harnessed this natural gene transfer mechanism to create a powerful vector for plants.
- Structure and Mechanism: The natural Ti plasmid contains a region called T-DNA (transfer DNA) , which is transferred from the bacterium to the plant cell and integrates into the host genome. The T-DNA carries genes for auxin and cytokinin synthesis (oncogenes), which cause uncontrolled cell division and tumor formation.
- Engineered Vector: To be used as a vector, the tumor-causing genes within the T-DNA are removed and replaced with a gene of interest and a selectable marker gene (e.g., an antibiotic resistance gene). This is known as a “disarmed” Ti plasmid.
- Binary Vector System: The modern approach uses a binary vector system . This involves two plasmids: (i) a small binary vector containing the modified T-DNA (with the gene of interest) and (ii) a helper Ti plasmid that lacks the T-DNA region but contains the vir (virulence) genes. The vir genes produce the proteins necessary for the transfer and integration of the T-DNA from the binary vector into the plant genome. This system is more efficient and easier to manipulate.
2. Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) Vector
The Cauliflower Mosaic Virus (CaMV) is a plant pararetrovirus with a circular, double-stranded DNA genome. It has been explored as a potential vector for plants.
- Features: The most significant contribution of CaMV to plant biotechnology is its 35S promoter . This is a very strong, constitutive promoter, meaning it drives high levels of gene expression in almost all tissues of a plant, at all times. The CaMV 35S promoter is one of the most widely used promoters in plant genetic engineering today.
- Use as a Vector: The use of the entire CaMV virus as a vector is limited. Its genome is small (around 8 kb), which restricts the size of the DNA that can be inserted. Additionally, it has a narrow host range and viral vectors often do not lead to stable integration into the host genome.
- Application: While its use as a whole vector is rare, its genetic elements, particularly the CaMV 35S promoter and the 35S terminator , are used almost ubiquitously in other vectors (like Ti plasmid-based vectors) to drive high-level expression of transgenes.
Q4. Write short notes on any two of the following: (a) pBR322, (b) Preparation of competent cells, (c) Lysogenic cycle
Ans. (a) pBR322 pBR322 is one of the first and most widely used artificial cloning plasmids developed for E. coli . It was created in 1977 and is named after its creators, Bolivar and Rodriguez. It is approximately 4,361 base pairs (bp) in length. The success of pBR322 was due to its well-defined genetic map and useful features that made it a workhorse in molecular cloning. Its key features are:
- Origin of Replication (ori): It contains an ori site that controls its replication in E. coli , leading to a copy number of about 15-20 plasmids per cell.
- Selectable Markers: pBR322 carries two antibiotic resistance genes: one for ampicillin resistance ( amp R ) and another for tetracycline resistance ( tet R ) . These genes are crucial for selecting transformed cells from non-transformed ones.
- Unique Restriction Sites: It contains several unique restriction enzyme sites useful for cloning. Importantly, several sites (e.g., Bam HI, Sal I) are located within the tet R gene, and others (e.g., Pst I) are within the amp R gene. This allows for the screening of recombinant plasmids by insertional inactivation . For example, if a foreign DNA is inserted at the Bam HI site, the tet R gene is disrupted, making the cell sensitive to tetracycline but still resistant to ampicillin. This allows for easy identification of colonies containing the recombinant plasmid.
(b) Preparation of competent cells Competence is the physiological state of a cell that allows it to take up foreign DNA from its environment, such as a plasmid. This process is called transformation. Bacteria like E. coli are not naturally very competent, so they are made artificially competent in the laboratory. The two main methods for preparing competent cells are: 1. Chemical Competence: This is the most common method.
- It involves treating the bacterial cells with a cold solution of calcium chloride (CaCl₂) on ice.
- The Ca²⁺ ions help to neutralize the negative charges on both the cell membrane and the DNA, allowing the DNA to get close to the cell surface.
- The cells are then subjected to a brief heat shock (typically at 42°C for 45-90 seconds). This heat shock is believed to create transient pores in the cell membrane, allowing the plasmid DNA to enter the cell.
- After the heat shock, the cells are immediately returned to ice and then allowed to recover in a nutrient-rich medium before plating.
2. Electroporation:
This is a more efficient but more expensive method.
- It involves subjecting a mixture of cells and DNA to a brief, high-voltage electric pulse.
- The electric pulse creates temporary pores (electropores) in the cell membrane, allowing DNA to enter the cell directly.
The goal of both methods is to make the cell membrane temporarily permeable to foreign DNA.
Q5. Explain the principle of any two selection methods used for identification of transformed cells.
Ans. After a transformation procedure, only a small fraction of cells successfully take up the foreign DNA. It is essential to identify and isolate these transformed cells from the vast population of non-transformed cells. Several selection methods are used for this purpose. The principles of two major methods are explained below. 1. Selection by Antibiotic Resistance
- Principle: This method’s principle is that the cloning vector (plasmid) carries a selectable marker gene that confers resistance to a specific antibiotic. For example, the amp R gene provides resistance to ampicillin.
- Procedure: After transformation, the mixture of bacterial cells (both transformed and non-transformed) is spread on an agar plate containing a nutrient medium supplemented with the specific antibiotic (e.g., ampicillin).
- Result:
- Cells that have successfully taken up the plasmid ( transformed cells ) express the antibiotic resistance gene. Consequently, they can survive and grow into colonies in the presence of the antibiotic.
- Cells that did not take up the plasmid ( non-transformed cells ) are sensitive to the antibiotic and are killed.
- Limitation: This method selects only for transformants but does not distinguish whether the plasmid is recombinant (i.e., contains the DNA insert) or non-recombinant.
2. Blue-White Screening (α-complementation)
- Principle: This method is used to differentiate cells with recombinant plasmids from those with non-recombinant plasmids. It is based on the principle of insertional inactivation of the lacZ gene.
- Requirements:
- A special vector containing the lacZα gene and a Multiple Cloning Site (MCS) within it.
- A host E. coli strain that has a defective version of the lacZ gene.
- A medium containing a chromogenic substrate (like X-gal) and an inducer (IPTG).
- Procedure and Result:
- Non-recombinants (Blue Colonies): If no foreign DNA is inserted into the MCS, the lacZα gene remains intact. It complements the host’s defective lacZ protein to form a functional β-galactosidase enzyme (α-complementation). This enzyme cleaves X-gal, producing a blue-colored product, and the colonies appear blue .
- Recombinants (White Colonies): If a foreign DNA is successfully inserted into the MCS, the lacZα gene is disrupted and inactivated. No functional β-galactosidase enzyme is formed. X-gal is not cleaved, and the colonies remain white .
- Conclusion: Thus, white colonies represent cells that contain the recombinant plasmid with the desired DNA insert, while blue colonies represent cells with the non-recombinant vector.
Q6. Mention the advantages, disadvantages and applications of genomic libraries.
Ans. A genomic library is a collection of DNA fragments representing the entire genome of an organism, with these fragments cloned into vectors and stored within a population of host organisms (like E. coli ). Advantages
- Complete Genome Representation: A genomic library contains all the genetic material of an organism, including coding regions (exons), non-coding regions (introns), regulatory sequences (promoters, enhancers), and all other DNA sequences.
- Source Independence: It can be constructed from any tissue, as every cell in an organism contains the same genome. It does not depend on the level of gene expression.
- Study of Regulatory Sequences: It is invaluable for studying the regulatory elements of genes, such as promoters and enhancers, which control gene expression.
- Genome Sequencing: It provides the source material for whole-genome sequencing projects.
Disadvantages
- Large Size and Complexity: Eukaryotic genomes are very large and contain a vast amount of non-coding DNA. This makes the library enormous and cumbersome to screen.
- Presence of Introns: Eukaryotic genes contain introns. If a gene from a genomic library is to be expressed in a prokaryotic system (like E. coli ), it will not work because prokaryotes lack the splicing machinery to remove introns.
- Difficulty in Gene Identification: Finding a single specific gene in a vast library can be very time-consuming and laborious, often described as “finding a needle in a haystack.”
Applications
- Gene Discovery and Cloning: To isolate and characterize specific genes (known or unknown) from an organism.
- Genome Mapping and Sequencing: To construct physical maps of the entire genome and determine its sequence (e.g., the Human Genome Project).
- Study of Gene Regulation: To identify and analyze promoters, enhancers, and other regulatory elements that control gene expression.
- Study of Genetic Diseases: To identify genes or mutations associated with hereditary diseases.
- Comparative Genomics: To study evolutionary relationships by comparing the structure and organization of genomes between different species.
Q7. Distinguish between the following: (a) Reverse Transcription PCR (RT-PCR) and Real Time PCR (qPCR), (b) Gene cassettes and Fusion genes
Ans. (a) Difference between Reverse Transcription PCR (RT-PCR) and Real Time PCR (qPCR)
| Feature | Reverse Transcription PCR (RT-PCR) | Real Time PCR (qPCR) |
|---|---|---|
Main Purpose |
To detect and amplify RNA molecules. It works by converting RNA into DNA first. | To measure (quantify) the amount of DNA during the PCR amplification in real-time. |
Starting Template |
RNA (e.g., mRNA). |
DNA or cDNA (which may be derived from RNA). |
Key Enzyme(s) |
Reverse Transcriptase in the first step, followed by a DNA Polymerase (like Taq). |
DNA Polymerase . If starting from RNA (RT-qPCR), Reverse Transcriptase is also used. |
Detection |
At the end of the reaction (end-point). Amplified products are visualized by gel electrophoresis. | In real-time, during the reaction. Amplification is monitored using fluorescence. |
Quantification |
Qualitative (yes/no) or semi-quantitative. Not precise for quantification. | Highly quantitative. It can determine the exact starting quantity of the template. |
Applications |
Detecting gene expression, diagnosing RNA viruses (e.g., HIV, SARS-CoV-2), cDNA cloning. | Precise measurement of gene expression, viral load determination, GMO detection. |
(b) Difference between Gene Cassettes and Fusion Genes
| Feature | Gene Cassette | Fusion Gene |
|---|---|---|
Definition |
A mobile genetic element that contains one or more genes and a specific recombination site ( attC ). |
A hybrid gene created by joining parts of two or more different genes. |
Main Function |
To be easily moved or “shuffled” from one genetic location to another. It acts as a modular unit. | To produce a single fusion protein that combines the properties or functions of the original proteins. |
Expression |
Typically lacks its own promoter and relies on a promoter present in a larger framework, like an integron, for expression. | Expressed as a single open reading frame (ORF) under the control of a single promoter. |
Structure |
Structure: [Recombination site] – [Gene] – [Recombination site]. Can be captured and expressed by integrons. | Structure: [Part of Gene A] – [Part of Gene B]. The resulting protein is a single polypeptide chain. |
Example |
Antibiotic resistance cassettes (e.g., cat , aadA ) that spread resistance in bacteria. Used as marker genes in molecular cloning. |
GFP fusion gene: A target protein is fused to GFP (Green Fluorescent Protein) to visualize its location in a cell. GST-tag fusion: to facilitate protein purification. |
Q8. (a) What is pyrosequencing? (b) List the applications of site-directed mutagenesis in agriculture and crop improvement.
Ans. (a) Pyrosequencing Pyrosequencing is a “sequencing-by-synthesis” method and one of the Next-Generation Sequencing (NGS) technologies. Its principle is based on detecting the pyrophosphate (PPi) that is released when a DNA polymerase incorporates a new nucleotide into a growing DNA strand. The process involves the following steps:
- A sequencing primer is annealed to the single-stranded DNA template.
- Only one type of deoxynucleotide triphosphate (dNTP), e.g., dATP, is added to the reaction at a time.
- If this dNTP is complementary to the next base on the template, DNA polymerase incorporates it. This incorporation releases one molecule of pyrophosphate (PPi).
- Another enzyme, ATP sulfurylase , converts this PPi into ATP in the presence of adenosine 5′ phosphosulfate (APS).
- The generated ATP is used by the enzyme luciferase to convert luciferin to oxyluciferin, which produces a flash of light.
- This light is detected by a camera and recorded as a peak on a pyrogram . The height of the peak is proportional to the number of nucleotides incorporated (e.g., two consecutive ‘T’s will give a double-height peak when dATP is added).
- Unincorporated nucleotides and ATP are degraded by the enzyme apyrase before the next dNTP is added.
The cycle is repeated, and the sequence of DNA is determined from the order of light signals generated.
(b) Applications of site-directed mutagenesis in agriculture and crop improvement Site-Directed Mutagenesis (SDM) is a powerful technique that allows for precise genetic changes to be made at specific sites in a gene. In agriculture, it is used to engineer crops with desirable traits. Key applications include:
- Herbicide Resistance: Modifying the enzymes in crops that are the targets of herbicides. For example, creating mutations in the EPSPS enzyme to make crops (like soybean, corn) resistant to glyphosate (e.g., Roundup).
- Improved Nutritional Value: Enhancing the nutritional content of crops. For instance, modifying metabolic pathways to increase the production of beta-carotene, the precursor to Vitamin A, in ‘Golden Rice’.
- Pest and Disease Resistance: Modifying plant genes to make them resistant to specific pests or pathogens, thereby reducing the reliance on chemical pesticides.
- Improved Shelf Life: Modifying genes involved in fruit ripening or softening to slow down these processes. For example, reducing the activity of the polygalacturonase gene in tomatoes.
- Abiotic Stress Tolerance: Developing crops that can withstand environmental stresses like drought, salinity, and extreme temperatures. This is done by modifying genes involved in stress-response pathways.
- Removal of Undesirable Compounds: Inactivating genes responsible for producing allergenic or toxic compounds in food crops.
Q9. Explain the applications of genetic engineering in agriculture. Enlist the problems associated with genetically modified plants.
Ans. Genetic engineering has revolutionized the field of agriculture by allowing for the direct modification of crop traits, leading to improvements in yield, nutrition, and sustainability. This is often referred to as the “Green Revolution 2.0”. Applications of Genetic Engineering in Agriculture:
- Crop Improvement:
- Pest Resistance: By introducing a gene (Cry gene) from the bacterium Bacillus thuringiensis (Bt), crops like cotton, corn, and brinjal have been made into Bt crops . These crops produce a protein toxic to certain insects (like bollworms), reducing the need for chemical insecticides.
- Herbicide Tolerance: Crops have been made tolerant to specific herbicides (e.g., glyphosate). This allows farmers to spray herbicides to control weeds without harming the crop. “Roundup Ready” crops are a prime example.
- Disease Resistance: Genes have been introduced to make plants resistant to viruses, fungi, and bacteria, thus reducing crop losses.
- Enhanced Nutritional Quality (Biofortification):
- Golden Rice: Engineered to produce beta-carotene, a precursor of Vitamin A, to combat Vitamin A deficiency in developing nations.
- High-lysine corn: The levels of essential amino acids like lysine have been increased to improve the protein quality for animal feed.
- Abiotic Stress Tolerance:
- Crops are being developed that can withstand harsh environmental conditions such as drought, salinity, and extreme temperatures.
- Post-Harvest Qualities:
- The ripening process has been slowed to increase the shelf-life of fruits and vegetables, as was done in the ‘Flavr Savr’ tomato.
Problems and Concerns Associated with Genetically Modified (GM) Plants:
- Environmental Concerns:
- Gene Flow: The uncontrolled spread of genes from GM crops to their wild relatives through cross-pollination could create “superweeds” that are resistant to herbicides.
- Impact on Non-target Organisms: Concerns have been raised that toxins from GM crops (like Bt toxin) could harm beneficial or non-target insects (e.g., the Monarch butterfly).
- Development of Resistance: Over time, pests may evolve resistance to Bt toxin and weeds may evolve resistance to herbicides, diminishing the effectiveness of these technologies.
- Human Health Concerns:
- Allergenicity: There is a concern that the introduction of new proteins could cause allergic reactions in some individuals. (However, all GM foods undergo rigorous allergenicity testing before reaching the market).
- Toxicity: Concerns have been raised about the long-term safety of novel gene products.
- Socio-economic Issues:
- Corporate Control: The seed market has become dominated by a few multinational corporations, which limits farmers’ choices.
- Intellectual Property Rights: Patented seeds prevent farmers from traditionally saving seeds from their harvest, forcing them to buy seeds every year.
- Consumer Acceptance and Labeling: There is an ongoing global debate about the mandatory labeling of GM foods, which is an issue of consumer choice and trust.
Q10. Write short notes on any two of the following: (a) Somatic cell gene therapy, (b) Dialysis, (c) Immunoaffinity chromatography
Ans. (a) Somatic Cell Gene Therapy Somatic cell gene therapy is a therapeutic technique that involves introducing a functional gene into the somatic cells (i.e., non-reproductive cells like blood cells, skin cells) of an individual to treat a genetic disease. Its key characteristics are:
- Non-heritable: Since it only modifies somatic cells, the genetic changes made are not passed on to the next generation. The modification is confined to the individual being treated.
- Purpose: Its main aim is to correct, replace, or supplement a defective gene’s function. For example, providing a correct copy of a gene to produce a missing or non-functional protein.
- Methods:
- Ex vivo : This involves removing cells (e.g., bone marrow cells) from the patient, genetically modifying them in the laboratory, and then reintroducing them back into the patient. This is a safer and more controlled approach.
- In vivo : In this method, the therapeutic gene, packaged in a vector (usually a modified virus), is delivered directly into the patient’s body (e.g., by injection).
- Example: The treatment of Severe Combined Immunodeficiency (SCID), where a functional copy of the adenosine deaminase (ADA) gene is introduced into the patient’s hematopoietic stem cells.
(c) Immunoaffinity Chromatography Immunoaffinity chromatography is a highly specific type of affinity chromatography that utilizes the strong and specific binding interaction between an antibody and its antigen to purify a target molecule (usually a protein) from a complex mixture. The main steps of the procedure are:
- Stationary Phase: A specific antibody (or antigen) is covalently attached to an inert matrix (like agarose beads) and packed into a column. This matrix is called the “immunosorbent”.
- Loading: The mixture containing the target molecule (the antigen) is passed through the column.
- Binding: As the mixture flows through, only the target antigen specifically binds to the immobilized antibody on the matrix. All other molecules in the mixture pass through the column unbound.
- Washing: The column is washed with buffer to remove any non-specifically bound molecules.
- Elution: The bound antigen is released from the antibody by changing the conditions. This is typically done by using a low pH buffer (e.g., glycine buffer, pH 2.5-3.0) or a competing ligand, which disrupts the antibody-antigen interaction. The purified antigen then flows out of the column and is collected.
This technique is very powerful due to its ability to achieve very high purity (>95%) in a single step. It is widely used in the purification of therapeutic proteins, antibodies, and vaccines.
Download IGNOU previous Year Question paper download PDFs for BBCCT-125 to improve your preparation. These ignou solved question paper IGNOU Previous Year Question paper solved PDF in Hindi and English help you understand the exam pattern and score better.
Thanks!
Leave a Reply